磁珠法试剂与Trizol试剂检测肠道病毒核酸的效果观察.pdfVIP

医学研究生学报2014年8月 第27卷 第8期 JMedPost~ra，Vo1．27，No．8，August，2014 ·893 · 论 著 摘 要 磁珠法试剂与Trizol试剂检测肠道病毒核酸的效果观察 王述莲，邓中平，呼建民，钟礼立 ，黄 河 [关键词】 肠道病毒；荧光定量PCR；磁珠法；Trizol法 【中图分类号】 R446 【文献标志码】 A [文章编号】 1008—8199(2014)08_o893 2 肠道病毒属于RNA病毒，是引起手足 口病 的主 检测过程 中配套使用。磁珠法和 Trizol法提取 的肠 要病原体。该病毒感染性强、致病率高_1-3]。快速 道病毒核酸，均采用美国Stratagene公司的Mx3000P 检测肠道病毒是治疗手足 口病的重要基础。 目前， 实时荧光定量PCR仪进行检测。 国内外常规检测肠道病毒的核酸提取方法是Trizol 1．3 方法 法，该方法需多次离心、洗涤、吸弃废液等开放操作， 1．3．1 磁珠法操作步骤 ①在 1．5mL灭菌离心管 过程中易造成污染和核酸丢失，也易导致检测结果 中依次加入600 LRNA提取 “溶液1”、200 L待测 重复性和稳定性不理想；而磁珠法是近年来研发的 样本、100 LRNA提取 “溶液2”，震荡混匀 10s后， 一 种较为先进的肠道病毒核酸提取方法，该方法为 室温静置 10min；(瞬时离心后，将离心管置于分离 常温裂解释放核酸，无需使用水浴或干浴设备，不必 器上，3min后吸弃废液；③ 向离心管中加入600 L 反复高速离心，操作方便，且节约成本。本文将肠道 RNA提取 “溶液 3”，加入 200 LRNA提取 “溶液 病毒核酸的磁珠法提取试剂与常规 Trizol法提取试 4”，震荡混匀5s，瞬时离心后将离心管再次置于分 剂进行对比观察，即以 “新型的”磁珠法肠道病毒核 离器上，3min后，将废液全部吸弃；(向离心管中加 酸提取试剂为观察试剂，以“常规的”Trizol法提取 入 30 LRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管 试剂为对照试剂，旨在探讨磁珠法试剂的临床检测 底，室温静置 10min后，将离心管再次置于分离器 效果。 上，静置 3min，然后将RNA洗脱液移入新的1．5mL 灭菌离心管中。 1 资料与方法 1．3．2 Trizol法操作步骤 ①在 1．5mL的灭菌离 1．1 一般资料 收集临床诊断为手足 口病患者的 心管中依次加入样本500IxL、Trizol试剂 500txL，充 咽拭子标本412例，其中男240例，女 172例；年龄 分混匀，室温放置 10min；②加入200 L氯仿，拧紧 l一12岁，平均4．5岁。所有病例确诊均严格按照国 盖，用力震荡 ，直至溶液充分乳化、成乳 白状、无分 家卫生部颁布的 《手足 口病诊疗指南》(2010年版) 相现象，室温静置 10min；③于4℃、13000r／min离 执行 。以“新型的”磁珠法肠道病毒核酸提取试 心 15min，吸取上层液相移入另一离心管；(加入等 剂为观察试剂，以 “常规的”Trizol法提取试剂为对 体积异丙醇，轻轻颠倒离心管，充分混匀液体，室温 照试剂。 放置 10min；⑤于4℃、13000r／min离心 15min，弃 1．2 主要试剂和仪器 “新型”肠道病毒核酸检测 上清；⑥ 向离心管内加入75％乙醇 1mL，震荡混匀， 试剂购 自湖南圣湘生物科技有限公司，采用磁珠法 于4℃、13000r／min离心1