GM-CSF与BZLF1融合基因修饰的重组BCG的构建与表达.pdfVIP

中国热带医学 2014~ g14卷第o9期 ChinaTropicalMedicine，September2014，Vo1．14，No．09 ·1035 · · 论 GM-CSF与BZLF1融合基因修饰的重组BCG的构建与表达 薛庆节，杨媛媛，胡文洁，吕厚东，李士根，陈延 济宁医学院病原生物学教研室，医学免疫学山东省重点学科，山东 济宁272067 摘要：目的 将人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子基因(GM—CSF)与EB病毒即刻早期基因(BZLF1)重组为融合基 因GCBF，并转化人卡介苗(BCG)中进行表达。方法 用随机引物Oligo(drI)15进行RT—PCR，分别获得人GM—CSF和 BZLF1编码序列的cDNA。将纯化GM-CSF和BZLF1PCR扩增产物插入分泌表达载体pMV261，并转化人感受态细胞 EscheriehiacoliDH5et(E．coliDH5ct)，在LB培养基上进行卡那霉素抗性选择 ，测序正确的序列进行剪接式重叠延伸，将 目的基因GM—CSF和BZLF1编码经多肽接头(Gly4Ser)3序列连接 ，构建融合基因GCBF，将GCBF克隆 pMV261，转化 感受态细胞E．coliDH5~t，在LB培养基平板上进行卡那霉素抗性选择 ，阳性克隆提取质粒后转化感受态BCG，west． ern-blot检测GCBF在rBCG中的表达。结果 目的基因GM—CSF和BZLF1RT—PCR产物大小分别为461bp和788bp， 与预期值一致。构建的重组质粒经双酶切、扩增及测序鉴定证实，融合基因GCBF(1209bp)t确插入载体，成功转化人 BeG感受态细胞，且被正确表达。结论 融合基因GCBF修饰的rBCG构建及表达成功，为进一步探讨rBCG杀伤EB病 毒阳性肿瘤的免疫活性研究奠定了实验基础。 关键词 ：融合基因GCBF；基因重组；重组卡介苗 中图分类号：R784 文献标识码：A 文章编号：1009—97272(014)9—1035—05 ConstructionandexpressionofrecombinantBCG encodingGM—CSFandBZLF1 fusiongene XUEQing-jie，YANGYuan—yuan，HUWen-jie，LVHou—dong，LIShi—gen，CHENTing DepartmentofPathogenicBiologyofShandongProvincialKeyDisciplineofMedicalImmunology,JiningMedcialCollege， Jining272067,Shangdong,P尼 China Correspondingauthor：CHEN Ting,E-maihchenting3465@163．corn Abstract： Objective To investigate the construction and expression of rBCG combining human grnauloeyte—macrophagecolonystimulatingfaetor(GM—CSF)nadEBvirus(EBV)encodingimmediateearlygene(BZLF1)． Methods Oligo(dT)15wasusedtoobtainhteeDNAsequenceofGM—CSFnadBZLFI，thepurifiedGM—CSFandBZLF1 wereamplifiedbyPCRnadinsertedintoplasmidpMV261，thentransformedthemintoEschedcbiacoliDH5u(E．coli．DH5cx)