人肝细胞核因子4α重组慢病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

岭南现代临床外科2014年 10月第 14卷第5期LingnanModemClinicsinSurgeryQct．914IYo1． ． 499 人肝细胞核因子 4oL重组慢病毒载体 的 构建与鉴定 邓洁敏 邓小耿 蒋雯丽 邱荣林 伍耀豪 曾乐祥 周嘉嘉 张杰 摘【要】 目的 构建肝细胞核因子4ct(hepatocytenuclearfactor4alpha，HNF4A)的过表达 慢病毒载体．并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定 ，为进一步研究 HNF4A的功能和作用机制奠 定基础 。方法 利用 PCR法扩增人类基因组 DNA中HNF4A的eDNA序列 ，并将其克隆至 PCDH—CMV—MCS—EFIa—GFP—puro慢病毒表达载体上，经双酶切及测序鉴定，将阳性重组 PCDH— CMV—HNF4A—EFla—GFP—puro表达载体、pCMV—VSV—G和pCMV—dR8．91三质粒共转染到 HEK一 293T细胞 ，收集上清 。将获得的病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染 HEK一293T细胞 ，并利用绿色荧 光蛋 白检测病毒滴度。将重组慢病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞 HFFs，并利用荧光定量 PCR检测HNF一4A的表达。结果 重组慢病毒表达载体PCDH—CMV—HNF4A—EFIa—GFP—puro酶 切及测序鉴定证明载体构建成功 ，并得到滴度为 1xl0sTU／mL的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维 细胞后 HNF4A表达显著增强。结论 通过优化载体构建方法成功构建人 HNF4A的重组慢病毒 载体并可在 HFFs内显著过表达 HNF4A，为 HNF4A的研究提供更高效稳定的基因载体。 【关键词】 HNF；HNF4A；慢病毒；载体构建 中图分类号：R602 文献标识码 ：A 文章编号：1009—976X(2014)05—0499—06 doi：10．3969／j．issn．1009—976X．2014．05．001 Construction and identification ofthehumna hepatocytenuclearfactor4a recombinna tlentivirus Deng皿min，DengXiaogeng，JiangWenli，QiuRonglin，WuYaohao，ZenLexiang，ZhouJiajia， Zhang肛 ．DepartmentofPediatricSurgery，SunYat—senMemorialHospital，SunYat—senUniversity， Guangzhou510120．Correspondingauthor： Xiaoge ng，dengxiaogen@aliyun．con． A【bstract】OMective Toconstruct，packageandidenti~therecombinantlentiviursoverexpressing hepatocytenuclera factor4alpha， HNF4A， and tolaythefoundationforfurtherstudythefunctions andmechanism ofactionofHNF4A．Methods ThehumanHNF4A cDNA wasamplifiedfrom thehuman genomicDNAbypolymerasechainreaction(PCR)，whichwasconstructedtothelentiviralexpression vectorPCDH-CMV—MCS-EF1a-GFP-puro．Afterenzymaticdigestionandsequencing，thepositiverecombinant PCDH-CMV-HNF4A—EFla-GFP-puroexpressionvector，pCMV—VSV—GandpCMV—dR8．91，threeplasmids werecotransfected intoHEK一293T cells，nextthesupernatantswereharvested．Aftergettingthevirus suspension concentrated， we make thegradientdilution to infectHEK一293T cellsand determinethe viurstiterby the green fluorescence p