猪传染性胃肠炎检测基因芯片与猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究.pdf

中文摘要 中文摘要 猪传染性胃肠炎(Transmissible 性胃肠炎病毒引起的一种高度接触性肠道传染病，临床症状主要表现为发病仔猪严重 腹泻、呕吐和脱水，该病给我国养猪业造成了巨大的损失。本研究从病原学上证实了 该病在四川的流行，建立了TGEV基因芯片检测新方法，进行了重要功能基因的分子 生物学研究，对TGE的诊断、预防和控制具有重要意义。 1猪传染性胃肠炎病毒SC_H株的分离鉴定 将腹泻病料接种到到ST细胞(猪睾丸传代细胞)上，连续盲传5代后开始出现 典型的细胞病变，病变在接毒后30h开始出现，表现为：细胞肿胀、变圆、有散在堆 传染性胃肠炎病毒阳性血清所中和，中和指数为242；透射电镜观察细胞中聚集大量 的病毒粒子，病毒粒子呈球形，大小约75—90姗，病毒以胞外分泌的方式释放到细胞 外；病毒对5溴脱氧尿核苷不敏感，为RNA病毒，对乙醚、氯仿敏感，对胰蛋白酶有 病的病原学研究、诊断和防制积累了材料。 2 TGEV SC-H株主要基因的克隆与分析 分别为378bp、852bp、1 sM、M、N、ORF7编码区的核苷酸序列和其他参考毒株的核苷酸序列同源性分别在 的克隆与分析为后续构建检测基因芯片和研究功能基因奠定了基础。 pq JII农业大学博L论史 3 TGE＼r检测基因芯片的初步构建 件及参数：在氨基化玻片上的一个阵列内，每个靶基因点l排，每排12个样点，点 与点中心距为650 ℃，点样后室温干燥过夜；60-80。C水合处理10sec；紫外线交联30min和0．2％SDS 洗涤5min，再以蒸馏水快速洗涤后离心干燥，密封保存。最佳靶基因点样浓度为 ． 为lh，杂交时间为6h，杂交温度为48℃。 能检测出最低含量为lOng／B1的探针。芯片的批间试验和批内重复试验结果均无显著 TGE检测芯片具有特异性好、灵敏度高，重复性好等优点．TGE检测芯片为TGE的诊 断提供了一种特异性更高的基因检测新方法，也可用于构建多个猪病联合检测芯片。 4猪传染性胃肠炎病毒Sc_H株N基因的表研究 用设计的一对引物从重组质粒pMD-N中扩增了猪传染性胃肠炎病毒N基因编码 体总蛋白含量的35．6％，重组N蛋白大小为47K1)a。重组蛋白以包涵体和可溶蛋白两 种形式存在于细胞质中，但以包涵体为主。对重组N蛋白用试剂盒进行了纯化，纯化 有抗原性。表达的N蛋白可用于研究蛋白结构、制备诊断制剂以及制备亚单位疫苗等。 关键词：猪传染性胃肠炎病毒；基因克隆i基因芯片；N基因；原核表达 英文摘要 Studieson of TGEVand of detecting expression genechiD TGEVSc_Hisolate of nucleocapsidgene Xiao—be(preventiveveterinarymedicine) Huang DirectedProf．WenXin—tian by of (LaboratoryMicroarray，SichuanAgricultural 625014) Abstract Porcinetransmissible a gastroenteritis(TGE)ishighlycontagious， diseaseofswinecaused transmissible enteric