ERK1%2f2信号通路调控糖尿病视网膜Muller细胞分泌血管内皮生长因子与作用研究.pdfVIP

复旦大学博士论文 中文摘要 血管内皮生长因子的作用研究 中文摘要 第一部分：糖尿病大鼠视网膜氧化应激、EIⅨ1／2信号通路激活 以及VEGF分泌的研究 目的：研究1)糖尿病大鼠模型早期视网膜是否出现氧化应激；2)糖尿病大鼠 模型早期视网膜氧化应激是否激活了ERKl／2信号转导通路；3)糖尿病视网膜 视网膜Muller细胞上的表达。 方法：腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型，取不同时间点：7天(d)、14天(d)、 氧化应激损伤相关指标，包括超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH) 浓度、丙二醛(MDA)浓度，电镜观察不同类型细胞(神经节细胞、Muller细 胞、血管内皮细胞、周细胞、色素上皮细胞)线粒体的超微结构。Western-blot 研究ERKl／2信号通路磷酸化激活的变化趋势。免疫组织化学的方法观察磷酸化 AP．1核转录因子激活的变化趋势。Real．time 膜ERKl／2磷酸化蛋白表达影响。 结果：氧化应激相关检查显示在糖尿病7d时视网膜就出现氧化应激损伤，表现 为SOD活性下降、GSH浓度下降、MDA浓度升高。糖尿病2m时表现出更显 2m时达到高峰，期间有上下波动波动。EMSA结果显示糖尿病成模后AP．1DNA 结合活性升高，并且波动趋势相似于磷酸化的ERKl／2。VEGF结果显示蛋白及 mRNA表达量均升高，波动趋势相似于磷酸化ERKl／2及AP．1。通过干预氧化 应激，ERKl／2磷酸化蛋白表达量下降。免疫组化结果显示DM7d视网膜内核层 出现磷酸化ERKl／2的阳性颗粒，并且在DM2m时表达更为增加。 讨论：1)在糖尿病模型极早期视网膜出现了氧化应激损伤，并且神经细胞的损 伤早于血管细胞。2)在糖尿病模型极早期视网膜ERKl／2信号通路激活，VEGF 蛋白量及mRNA表达升高，两者间波动趋势相似。ERKl／2下游核转录因子AP．1 复旦大学博士论文 中文摘要 的波动也表现出类似趋势。3)干预氧化应激能抑制ERKl／2磷酸化激活，提示 存在ERKI／2信号通路的激活。 及ⅦGF的分泌影响研究 目的：研究1)体外培养的Muller细胞在高糖环境下氧化应激损伤；2)高糖环 核转录因子AP．1是否激活；4)高糖环境下Muller细胞VEGF分泌的变化。 方法：取新生大鼠视网膜Muller细胞纯化培养。传代后2．3代细胞，高糖(30mM) 聚焦显微镜观察线粒体膜电位的下降，电镜观察线粒体超微结构。Western-blot 方法观察高糖刺激24h后ERKl／2磷酸化激活的表达量，细胞免疫荧光观察 DNA探针结 ERKl／2磷酸化激活的表达。EMSA方法观察高糖刺激24h后AP．1 合活性。Real．timePCR检测AP．1的主要组成元件c．Fos和c．JunmRNA表达量。 Real．time PCR检测高糖刺激8h、12h、24h、36h、48hVEGFmRNA表达量，ELISA 检测高糖刺激8h、12h、2411、36h、48h培液中VEGF浓度。 结果：随高糖刺激时间的不断延长细胞内ROS逐渐升高，在24h骤升(PO．05)。 高糖刺激24h后细胞线粒体膜电位下降，并且电镜下线粒体超微结构发生异常改 胞核内。高糖刺激24h后Muller细胞内AP．1DNA结合活性升高，Real-time显 PCR显示VEGF 示c．Fos和e-JunmRNA表达量也升高(P0．05)。Real．time 高糖刺激后升高，并且在24h表现为高峰(PO．05)。 讨论：1)高糖刺激可致体外培养Muller产生氧化应激损伤；2)高糖刺激24h， VEGF增多，高于正常对照组，而且在24h表现为高峰期。 第三部分分别干预氧化应激及拮抗ERKl／2信号通路对VEGF 分泌的作用 分泌的作用。 复旦大学博士论文 中文摘要 EMSA研