SARS-CoV核衣壳蛋白的抗原性鉴定与基因免疫研究.pdfVIP

NCL M 论文汇编 MLCCCC4002 CO一9 SARS—CoV核衣壳蛋白的抗原性鉴定和基因免疫研究 柯金山 于嘉屏 第二军医大学附属长征医院实验诊断科200003 赵平戚中田 第二军医大学微生物学教研室 acute 严重急性呼吸综合征(severe 次，共注射三次。 respiratorysyndrome． 1 N SARS)的传染性和致病性极强，已确定其病原体为一种新型冠状 6小鼠抗SARS—CoYIgG的检测 病毒，被称为SARS冠状病毒(SARS—CoV)o”。冠状病毒是一类球 形、有包膜的正链RNA病毒。病毒包膜内侧，是病毒核衣壳蛋白周的小鼠血清以12％山羊血清／0 (N蛋白)包饶全长约30kb基因组RNA而组成的核衣壳。动物冠 状病毒的研究发现，N蛋白具有较强的抗原性，诱导的细胞免疫 N 应答能促进病毒清除目。本研究在大肠杆菌表达SARS—CoV的NDAB—H202呈色，测A450 A450 蛋白，并构建N基因的DNA疫苗进行小鼠免疫实验，评价该 DNA疫苗诱导的体液和细胞免疫应答，为进一步研究SARS—CoV2．1倍确定为抗体阳性。 的免疫学特点和．sARs的特异性防治方法奠定基础。 1 7小鼠T细胞增殖反应的检测“ 1．材料与方法 末次免疫后4周，两组小鼠各处死4只，无菌取脾脏，制备 1 1材料 SARS—CoY全长N基因由上海博亚生物工程公司参照 96孔细胞培养板，加入重组N蛋白，补充RPMI1640培养液至 GenBank AY278554的序列合成。原核表达质粒载体pPROEX HTa为LIFETECHNOLOGIES产品。Ni—NTA亲和树脂纯化试剂 每孔加MTS 为Qiagen产品。SARS患者恢复期血清获自北京小汤山医院，经 刺激指数(stimulation 56℃加热30min的灭活处理。真核表达质粒载体pCl—neo和非放 射性细胞增殖检测试剂(MTS)为Promega产品。6周龄的雌性A590nm／阴性对照}L平均A590nm。 BALB／c小鼠购自上海西普尔一必凯实验动物有限公司。HRP一山 1．8小鼠迟发型超敏反应(DTH)的检测 羊抗人IsG、HRP一山羊抗小鼠IgG为Sigma产品。 末次免疫后4周，两组小鼠各取4只，于每只小鼠的左后足 1．2N蛋白原核表达载体的构建 垫内注射201xg重组N蛋白(溶解于25p．1PBS)，右后足垫内注射 合成引物：NF：5，—GAAⅢACCATGCTGATAATGGACCC- 251xl CAATC_3；NR：5．_GAA订CTGCAGCGGCCGCTrATOC(船A(册G右后足垫厚度，根据左右后足垫厚度之差比较两组小鼠的水肿反 AATCAGCAG一3；以合成的基因为模板，PCR扩增N基因，PCR产应。 1 物插人Pmd一18T载体(TaKaRa)，经DNA测序证明序列正确以9统计学分析 后，EcoRl酶切出N基因，插人载体pPROEXHTa的EcoRI位有关数据的统计学分析用student7St检验 点，以HindllI酶切鉴定插入方向，得到重组质粒pHT-N。 2．