细菌对四环素类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒研究和应用.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二农学术研讨会 细菌对四环素类药物耐药基因三重PCR检测 试剂盒研究和应用6 夏青音。，王虹宁2．黄勇’，柳萍1．张安云1．用万暮1，扬鑫’ (1-四川农业大学动物科技学簏，雅安四川6250142．四川大擘‘‘985工程”西南蚤源环境与灾害防治 科技创新平台，四川走学生命科学学虎，四川大学动物疾病防控生物工程研究中·o，成都，6l0064) 摘要本实验旨在研制一种细菌对四环素类药袖耐药基因三重PcR快速检洲试剂盒，用于快速，准确的 检测各种细菌十的四环素类药物耐药基因．根据时G∞Bank上已注册的四环素粪耐药基因ttA，teIc．懈M 的多书基因序列进行分析放计引物．使用三重PcR法快速检测标准茵株中的耐药基因，在此基础上不断优 化各种反应条件研制出三重PcR检测试荆盒．用本实验研制辑试齐J盒检．捌了从奎国16十省市规模化猪场， 鸡场粪样中分离的248株大肠杆茼和沙门氏茵，井将检测结果与药敏实验结果相比较．结果：试卉4盒能够 准确的检出三种耐药基因．从而探明四环素类药物耐药基因的滴行规律与趋势．与传统方法相比，本试剂 盒能太太缩短检测时闻．节省检测成本．应用实验显示，基因检测与药敏实验符合率为66％，两种方法具 有较高的一致性．目前，霉内并没有类似的四环素类药物耐药基因三重PcR快速检测试舟】盒，本实验的研 究结果填补了连一项空白． 关键词四环素，耐药，猪。鸡，犬肠杆茸，沙门氏茵，三重PcR，试剂盒 伴随着四环素类药物(包括：四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、美满霉素等)的广 泛使用和近年来我国规模化养殖场高度集约化的发展，猪场、鸡场中太肠杆菌、沙门氏菌对 四环素类药物的耐药性表现得越来越严重。更为可怕的是，细菌一旦对四环素类抗生素产生 耐药性，这种耐药性又可通过耐药因子(R．质粒)传递给其他敏感细菌lIJ，甚至可以通过猪 肉、鸡肉的加工，食用等过程将耐药性传播给人类．给人类的健康带来巨大的，潜在的隐患。 因此，高效，快速，准确的检测大肠杆菌四环素类药物耐药性，同时，根据耐药性检铡 结果制定相应的用药规范，对人类食品安全，健康养殖．减少和控制发病率等都至关重要。 由于现在国内没有检测四环素类耐药基因的试剂盒，本实验研制了一种同时检测四环素类药 物3个常见耐药基因的三重PCR检测剂盒。并用这个试剂盒检测了全国16个省市分离的 248株细菌的三种常见四环素耐药基因。试剂盒能够准确的检测出细菌中的耐药基因，同时， 可以把握其耐药基因的流行规律和趋势，控制细菌耐药性的发展。本实验对掌握规模化猪场 大肠杆菌的耐四环素类药物的流行情况提供了科学依据，在食品卫生和公共卫生方面具有重 要意义． 1材料与方法 1．1菌株 均已通过测序鉴定。 2006年，在全国l6个省市(四川省，重庆市，湖北省，河南省，湖南省，浙江省．广 西省，福建省，山东省，河北省，陕西省．辽宁省。吉林省，黑龙江省，山西省，宁夏回族 自治区)不同地区的规模化猪场、鸡场粪样中分离鉴定的大肠杆菌、沙门氏菌共248株。其 中，大肠杆菌200株。沙门氏菌48株。 1．2主要试剂 M-H培养基、伊红美兰培养基、营养琼脂培养基、SS培养基，LB培养基，甘油等： 药敏实验供试纸片：四环素，美满霉素，多西环素药敏纸片(购自杭州微生物试剂有限 DNAladder购自天为时 公司)，呐DNA聚合酶、Mgcl2、PcR产物胶回收试剂盒、100bp 6基金项目：国家“十五”重点科技攻关子课题(2002B”14A-12．5) 国家农业科技成果转化基金项目(告问号：05EFN215lI)0243) 作者简舟：夏青青(1983)，女，四川成都人，硬士研究生，主要从事动物预防医学与分子生物学研究．E．m臣订： 盟匝瞳圣i必h螋：￡Q坐墨n 通讯作者：王红宁。教授，博士生导师，主要从事畜青传染病，微生物生物工程的研究．电话：028 E-man：whongn吨@163．∞m 其他论文 代有限公司，100b口DNAMal(盯购自上海TIANGEN生物工程公司。琼腊塘，购白天泰生物工 程科技有限公司． 1j药敏实验 以ATCC25922作药敏质控菌。采用药敏纸片法(K-B法)测定