南太平洋表层海水微生物的群落特征摘要：在南太平洋环流区.docVIP

南太平洋表层海水微生物的群落特征 摘要：在南太平洋环流区表层海水这一世界上最干净水体的特殊海洋生态环境中，形成了特殊的海洋微生物群落结构。因此，对这一区域海洋微生物群落组成的研究有助于更深入分析海洋微生物的生态分布特征乃至于全球海洋微生物的分布，以及对整个海洋生态系统的影响。本研究项目通过对南太平洋表层海水的可培养细菌进行分离纯化、DNA提取、16S rDNA的PCR扩增和测序来探究南太平洋表层海水微生物群落的多样性。我们通过传统平板培养法一共分离了74株可培养的细菌，进行了16S rRNA基因的全长测序,并到NCBI数据库中进行同源性检索，确定了它们的分类地位并对它们进行了系统发育分析。结果表明，南太平洋表层海水中存在的可培养细菌分别属于变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。其中变形菌门47株、拟杆菌门12株、厚壁菌门11株，放线菌门4株；变形菌门中，α-变形菌纲5株和γ-变形菌纲42株。基于16S rDNA序列分析发现，一共有14 株细菌鉴定为潜在的新种，其中有6株与已知细菌的相似度低于94%，有可能成为潜在的新属。 关键词：南太平洋环流；细菌； 16S rDNA序列；可培养；多样性 前言 南太平洋是太平洋南部的海域，大约在赤道以南到南纬60度的海域。南纬60度到南极的水域都被归入南冰洋的范围。介于20(-45(S的南太平洋环流区是世界上最大的大洋环流区，其微生物的群落特征与其他海区有较大的不同，可能蕴育着特殊的微生物物种及新颖的代谢方式。南太平洋环流是全球大洋环流的重要组成部分，它受着南极大陆环流的影响，进而影响着海洋环流的整体隔热作用。而南太平洋亚热带环流作为世界中部环流区，它所处特殊的地理位置对其海水表面和海底沉积物中的微生物生长环境、新陈代谢活动、遗传结构以及组合特征的影响具有的特殊性值得探究。 南太平洋环流区的表层水是世界上最干净的水体，其叶绿素和初级生产力水平均低于其他洋区，其表层水中的微生物含量也少于其他洋区。对于表层水及底层水的海洋微生物群落特征的研究有助于解释环流区的生物群落在生物地球化学循环中的作用。 本项目以张老师在IODP 329航次过程中采集的南太平洋表层海水微生物为研究对象，研究目前世界上尚未有人染指的南太平洋表层海水微生物的群落。此项目对于认识南太平洋海水微生物的群落特征，探究海水微生物对南太平洋环流区的生物地球化学循环的影响有着重要意义。 2.材料与方法 2.1 样品来源：实验所用样品均来源于IODP 329航次在南太平洋四个站位的取样，分别是U1368,U1369, U1370,U1371。 2.2 菌种的活化与活化 从-80°C冰箱中接出以培养的菌种，在超净工作台用接种环无菌操作挑取菌种，划线接入2216E或R2A固体平板，28℃培养至长出单菌落。 用接种环挑取活化后细菌的单菌落在新的平板上划线，进行再纯化，28℃培养至长出单菌落。此步骤最少重复一次，直至长出形状大小单一的单菌落。 2.3接斜面 选取单菌落到斜面培养基上进行划线，在28℃恒温培养箱中培养直至富集出较多的菌体，以待DNA的提取和菌种保藏。 2.4 菌种保藏 以4.5 ml灭菌保种液 (0.85%NaCl溶液+ 15%甘油) 洗下斜面上的菌苔，制成菌悬液，用灭菌的巴氏管吸出1.5ml到一个保种管中，严实密封保种管，每个菌种保存3管，保存于-80℃的超低温冷冻箱中。 2.5细菌染色体DNA的提取 方法一：酚—氯仿提取法 在琼脂斜面上培养24h的细菌，1.5ml生理盐水洗脱，取1.0ml菌悬液于1.5ml塑料离心管中4°C，10000 rpm离心10min收集菌体； 用0.5ml提取液（pH8.0TE缓冲液475(l + 10%SDS25(l +蛋白酶K5(l）溶解混匀，55°C水浴1-2h； 加等体积饱和酚，混匀12000rpm离心10min，吸取上清； 上清加等体积氯仿：异戊醇（24：1）约400(l混匀，12000rpm离心10min吸上清； 重复上一步； 吸上清，1/10体积的乙酸钠（离心管中液体体积的1/10），再加二倍体积的无水乙醇（离心管中液体体积的2倍），混匀-20°C保存2h或过夜； 取出后14000rpm冷冻离心10min，弃上清，用70%乙醇轻洗沉淀2—3次，倒置干燥（放在超净台上）； 加50(l灭菌双蒸水，-20°C保存。 方法二：煮沸法 在琼脂斜面上培养24h的细菌，用1.0mlTE缓冲液洗脱，100°C水浴10min，置冰浴保存20min左右， 4°C 12000r/m离心10min，吸上清0.5-1ml做PCR模板，-20°C保存。 2.6 PCR扩增16S rDNA片段