利用a凝集素在酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2.pdfVIP

微生物学报ActaMicrobiologicaSinica 48(11)：1543-1548；4November2008 ISSN0001-·6209；CN11-·1995／Q http：／j／ournals．im．ac．cn 利用a凝集素在酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2 刘文山 ，徐莉料，赵鹤云，杨江科，闫云君 (华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074) 摘要：【目的】将解脂耶氏酵母胞外脂肪酶 Lip2展示在酿酒酵母表面，构建全细胞催化剂。【方法 】 采用PCR方法扩增得到解脂耶氏酵母胞外脂肪酶 Lip2成熟肽编码基因 2，将其连接到AGA2基 因的下游构建表面展示载体 pCTLIP2。分别以橄榄油、三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯 (pNPP) 为底物检测展示的脂肪酶酶活。在此基础上，对野生菌及工程菌的酶学性质进行 比较。【结果】展示 Lip2的酿酒酵母重组菌株在半乳糖的诱导下，表现出水解橄榄油、三丁酸甘油脂以及pNPP的活性， 20E诱导 72h时酶活达到最高，为 182U／g干细胞。对展示的Lip2的酶学性质研究表明，其最适温 度为4O℃，最适pI4为8．0，温度稳定性比自由酶有所提高，50℃温浴 4h后残余酶活为其最大酶活 的23．2％。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性，结果显示其水解 C8，C12，C16 对硝基苯酚酯活性相近，均远高于对硝基苯酚丁酸酯 (C4)的水解酶活。【结论】对于Lip2，a凝集 素系统是一个有效的展示系统 ，利用该系统成功将Lip2展示在酿酒酵母表面，从而构建了酿酒酵母 全细胞催化剂，该全细胞催化剂具有良好的潜在应用前景。 关键词 ：脂肪酶；解脂耶氏酵母 ；酿酒酵母；表面展示 中图分类号：Q814 文献标识码：A 文章编号：0001—6209(2008)11—1543—06 脂肪酶 (Lipase，EC3．1．1．3)是一种工业上广泛 的纯化过程。而目前国内外均没有表面展示 Lip2的 应用的水解酶类，它可以催化三酰基甘油酯水解 、酯 报道。 化 、转酯、氨解等反应。被广泛应用于洗涤剂 、油脂 酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)由于其安 与食品加工、有机合成、皮革与造纸工业等领域。解 全、能对真核蛋白进行有效的分泌和折叠等优点，其 脂耶氏酵母 (Yarrowialipolytica)胞外脂肪酶 Lip2 展示不同的蛋 白已经被广泛应用到了越来越多的领 具备很高的水解、酯化、转酯活性 l【】，已被应用到酯 域，如蛋 白质工程、细胞吸附、分子识别、全细胞催 合成、对映体拆分、生物柴油等领域I2】。然而，多 化、生物转化、生物治疗、信号转导、生物传感器和 数游离脂肪酶对温度及有机溶剂的稳定性较差，反应 疫苗等 5【6】。目前酿酒酵母中的多个细胞壁蛋白均被 产物分离困难 ，这些都有待改进以适应不同工业生产 用于表面展示，其中脂肪酶的表面展示主要是用 0凝【 条件的需求。利用微生物表面展示技术则可以较好地 集素和 Flol作为载体蛋白 ]，未见有 a凝集素用于 解决上述问题。微生物表面展示技术一方面可以作为 脂肪酶表面展示的报道。 脂肪酶蛋白质工程中的一种高通量筛选手段 ，另一方 本研究利用酿酒酵母表面蛋白fl凝集素作为载 面则可以作为全细胞催化剂，它不仅具备传统固定化 体蛋白第一次将解脂耶氏酵母脂肪酶 Lip2成功地展示 酶的诸多优点，而且与传统固定化酶相 比不需要复杂 在酿酒酵母表面，同时还考察了最佳诱导时间以及最适 基金项 目：国家 8“63计划”(2006AA020203，2007AA05Z417)；武汉市攻关项目(200720422138) 通讯作者。Tel／Fax：+86—27E-mail：yanyunjun@tom．tom 作者简介：”并列第一作者。刘文山(1981一)，男