动物组织中核酸的提取与鉴定实验方案.pptVIP

动物组织中核酸的提取与鉴定 实验原理 本实验运用盐溶液法用动物肝脏分离制备DNA 核酸在细胞内都与蛋白质结合成核蛋白，要分离核酸必须使核酸与蛋白质分离并除去蛋白质。 已知在0.14mol/LNaCl溶液中核糖核蛋白溶解度最大，而脱氧核糖核蛋白溶解度最小，在1mol/LNaCl溶液中脱氧核糖核蛋白溶解度增大，核糖核蛋白的溶解度则明显下降，根据这种特异性即可把这两种核蛋白分开 实验原理 十二烷基硫酸钠（SDS）处理，使蛋白质变性，蛋白质与DNA分开 氯仿—异戊醇除去变性蛋白质 冷的95%乙醇除去蛋白质，溶液中的蛋白质沉淀出来 柠檬酸、EDTA等螯合物可以防止DNA酶降解DNA 实验试剂 PH=8.0 0.14mol/L NaCl-0.01mol/L EDTA溶液 50g/L 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液 氯仿—异戊醇混合液（氯仿：异戊醇=24：1） 氯化钠溶液（75%乙醇、95%乙醇） 试验器材 材料：动物猪肝（猪羊兔） 组织捣碎机、离心机、量筒、烧杯、锥形瓶、玻璃棒、离心管、称量瓶、滴管等 实验步骤 取动物肝脏浸入预先在冷水浴中冷却的0.14mol/L NaCl-0.01mol/L EDTA溶液，反复洗涤几次，直至组织无血为止 将洗净的组织剪成碎块，称取10g，加入20ml 0.14mol/L NaCl-0.01mol/L EDTA溶液，在组织捣碎机中匀浆，4℃ 4000r/min离心15分钟后弃上清液，在沉淀中加入4倍体积的低温0.14mol/L NaCl-0.01mol/L EDTA溶液,搅匀后离心，弃上清液，如此反复2-3次，保留沉淀 实验步骤 将沉淀物悬于5倍体积的0.14mol/L NaCl-0.01mol/L EDTA溶液中搅匀，边搅拌边滴加SDS溶液，直至SDS的最终浓度达10g/L为止，然后加入固体NaCl，使NaCl最终浓度达1mol/L,继续搅拌30-45min,以确保NaCl全部溶解 将上述混合液倒入一个具有塞的锥形瓶中，加入等体积的氯仿-异戊醇，振荡10min在室温3000r/min离心10min 此时可见3层，小心吸取上层水相，记录体积，放入锥形瓶中再加入氯仿-异戊醇混合物，振荡离心，如此反复抽提数次，直至界面处不出现蛋白凝胶为止 最后一次离心后，小心吸取上层溶液计量体积，放入干燥小烧杯，加入2倍体积的预冷95%乙醇，产生沉淀后，4000r/min离心10min弃去上清液，沉淀即为DNA 实验步骤 加2倍体积预冷乙醇，如用滴管滴加，边加边慢慢顺一个方向在烧杯中搅动，有粘稠维丝物缠在玻璃棒上，直至再无丝状物缠上为止 将玻璃棒上的DNA取下，依次用75%乙醇、95%无水乙醇洗一次，放入干净量瓶中至于干燥器中抽干 十二烷基硫酸钠（SDS） 组织捣碎机 离心机 * *