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茶科技与产业发展论坛论文集 基因工程菌生物合成茶氨酸的研究现状与展望 王丽鸳，成浩，周健，陆文渊，王贤波，朱文娴 伸国农业科学院茶叶研究所，国家茶树改良中心，浙江杭州310008) 茶氨酸是茶树中特有的一种氨基酸，具有降低血压、抵消由咖啡碱引起的兴奋、保 护神经细胞等多种生理功能，在医药、食品等行业具有较高的应用潜力【1】。目前已经 进行过探索的生产方法主要有从茶叶中提取、化学合成、微生物发酵和植物细胞培养等。 化学合成茶氨酸工艺复杂，而且存在有毒物质残留问题；而组织培养法合成茶氨酸周期 长、生产成本高，还不能进行工业化生产。另外，由于茶氨酸在自然条件下含量少，提 取制备茶氨酸成本高。因此通过微生物发酵合成茶氨酸是合成制备茶氨酸比较有前途的 研究方向。课题组在浙江省科技计划和中国农业科学院院本级项目的支持下开展茶氨酸 生物合成方面的研究。本文分四个方面，将本项目的研究现状进行综述。 1茶氨酸生物合成基因工程菌株的构建及质粒稳定性研究 1．1茶氨酸生物合成基因工程菌株的构建 目前已经发现的可以催化茶氨酸合成的酶主要有3种：茶氨酸合成酶(Theanine synthetase，EC 胺酶(L．Glutaminase，EC 3．5．1．2)【4．5】。其中，茶氨酸合成酶是茶叶中的生物合成酶， 但一直未能将其基因克隆出来；其它两种酶来自微生物，比较方便进行利用。 为了获得具有高茶氨酸生物合成能力的大肠杆菌菌株，我们分别将来自于大肠杆菌 粒转化到E．coli moFLIPTG，32C诱导表达，湿菌体的酶活达到2．0 工程菌株经0．05 U／g，大约是出发 菌株E．coli 表达。工程菌催化L．谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29．40g／L，L．Gin 的转化率为48．22％，其催化L．谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株 E．coli DH5u提高了100多倍。 mmol／LIPTG，28℃诱导表达，湿菌体的酶活达到41．79 pET-GS工程菌株经0．1 U／mg BL21的126．64倍。工程菌催化L．谷氨酸钠和盐酸乙胺反 prot，大约是出发菌株E．coli 茶科技与产业发展论坛论文集 应生成茶氨酸的产量达到6．2g／L，其催化L．谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能 力较出发菌株E．coli BL21有显著提高。 1．2茶氨酸生物合成基因工程菌株质粒稳定性研究 基因工程菌的质粒不稳定现象在生产实践中普遍存在，它会导致基因工程菌的应用 受到一定的限制，通常质粒稳定性的高低，还对基因工程菌发酵的产物收率有很大影响， 同时也是实验室中的成果能否转化为生产的关键问题。 我们对茶氨酸生物合成基因工程菌重组质粒pET-GGT的结构稳定性和分裂稳定性 进行了研究【7】。结果表明，该基因工程菌在氨苄青霉素选择压力下．连续传代100代 后，质粒的目的基因片断没有缺失，具有结构稳定性：但在无抗生素选择压力下，连续 传代20代后开始出现质粒丢失的细胞，连续传代100代后18％的细胞含有正常质粒， 因此，表现出一定的分裂不稳定性。该基因工程菌在优化培养基和优化条件下的整个发 酵过程中，始终表现出良好的结构和分裂稳定性(见图1)。因此，为了保证该基因工 程菌的正常生长及表达，在保藏、传代及发酵过程中必须添加Amp来控制其重组质粒 的稳定性。该基因工程菌在质粒稳定性方面可以进一步应用于扩大生产，满足工业化生 产的要求。 0 O 0 O 0 O ^事v爵隶妞g霉最翟烬缸 M詈州．10q皇，口叫暑∞时一厶uo——墨ukoAv 啪m∞巯：30粕oD