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腺病毒载体转染Ho．1基因胰岛移植的实验研究
中文摘要
目的：
1、建立腺病毒载体转染人HO一1(heine
oxygenase．1，血红素氧合酶一1，热休
克蛋白32)基因的技术方法。
胰岛技术方案，为胰岛的体外培养及体内移植实验奠定基础。
3、建立以腺病毒为载体转染人HO．1基因至胰岛细胞的方法确定最佳的
of
MOI(multiplicitiesinfection，感染复数)。
4、了解HO一1基因对胰岛细胞的作用，及腺病毒对胰岛细胞形态和功能的影
响。并确定人HO．1基因在转染胰岛细胞中的表达情况。
5、建立同种异体成年大鼠门静脉内胰岛移植模型。了解HO．1基因对移植胰
岛是否具有抗凋亡、延长移植物存活时间、减少淋巴细胞浸润、抑制免
■，，0●I，●●，
疫排斥反应的功能，为基因转染胰岛细胞移植的临床应用奠定基础。
方法：
1、使用测序仪对质粒载体pobtt进行测序，并和人HO一1基因序列进行比对，
chain
reaction，聚合酶链式反应)对构建好的腺病
通过PCR(polymerase
毒载体Ad．HO．1进行鉴定，鉴定质粒载体和腺病毒载体是否包含人HO一1
frame，开放式阅读框架)，对腺病毒载体
基因的ORF(openreading
Ad．HO一1进行扩增、纯化并进行滴度鉴定。
2、采用Ricordi等报道的方法，分离纯化成人胰岛。采用胆总管原位插管，
胶原酶P液(1mg／m1)灌注，374C水浴消化、分离大鼠胰岛，Ficoll400
(菲科尔400，水溶性聚蔗糖400)问断密度梯度方法纯化胰岛。采用DTZ
(Dithizon，双硫棕)染色鉴定胰岛并计算IEQ(islet
equivalent，胰岛当
量)、AO／PI(acridine iodide，吖啶橙一碘丙啶)双色荧
orange／Propidium
光染色法测定胰岛活率，胰岛素释放试验鉴定胰岛细胞胰岛素分泌功能。
绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体)转染成人及成年大鼠胰岛，通过荧光显
微镜观察增强型绿色荧光蛋白表达强度和表达时间，将转染EGFP基因的
胰岛使用0．05％胰蛋白酶(含0．53mmol tetraacetic
EDTA，ethylenediamine
acid，乙二胺四乙酸)短暂消化并吹打成单个细胞后使用流式细胞仪检测
‘EGFP表达效率，结合参考文献确定转染胰岛Ad．HO．1的最佳MOI。
复卫大学2006辛绰壬静立
4、将分离纯化获得的胰岛分为3组：HO．1组(胰岛使用Ad．HO．1进行转染，
(不使
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