柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发的研究.pdf

柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发研究 摘要 本研究以38个组合的柑橘体细胞杂种(或胞质杂种)为实验材料，综合应用RFLP、 CAPS和epSSR分子标记技术，对这些杂种的线粒体和叶绿体遗传组成进行了分析；同 时对实验技术体系进行了完善与拓展，开发了柑橘叶绿体SSR标记；并对柑橘愈伤组织 长期继代保存过程中胞质基因组遗传变异进行了分析，主要结果如下： 水饱和乙醚处理能有效去除多糖，获得高纯度的DNA样品。用此方法能获得衰老、萎 蔫或霜冻柑橘叶片的高质量DNA样品。在其它30余种热带、亚热带果树作物中试验也 同样有效，证明该方法对这些富含蜡质层和多糖的作物普遍适用。 2、对4个属间组合的体细胞杂种和3个种间组合的胞质杂种(或体细胞杂种)的5 个叶绿体区域和3个线粒体区域进行了。谨S分析。4个属间体细胞杂种组合检测到了 线粒体多态性位点：而在3个属间组合和2个种间组合中检测到了叶绿体多态性位点。 所有杂种的线粒体多态性位点与悬浮系亲本一致，叶绿体与叶肉亲本或悬浮系亲本一 致。 3、用5种限制性内切酶对38个组合的杂种DNA进行酶切，并与12个线粒体探针 随机组合进行RFLP分析。结果表明：柑橘体细胞杂种线粒体的来源偏向于悬浮系亲本， 且普遍发生遗传重组；杂种线粒体的遗传组成受核背景的影响，异源四倍体体细胞杂种 较二倍体胞质杂种的线粒体的遗传组成更为复杂：双亲共有的线粒体区域很容易传递给 杂种后代。另外，线粒体的传递能力与亲本的基因型有关，在起源与进化中越古老的品 种，将其线粒体传递给后代的能力越强。 4、对伏令夏橙+宁波金柑的体细胞杂种在1年中按月连续采样，进行RFLP分析 结合田间观察，发现线粒体DNA的丢失会导致植株的枯死，表明体细胞杂种的生长异 常与线粒体遗传不稳定性有关。 性，整体上呈现随机分离的趋势。现有的标记无法完成对其余组合叶绿体来源的分析， 必须寻求新的叶绿体标记方法。 6、 开展了体细胞杂种及胞质杂种的线粒体和叶绿体基因组的RT-PCR分析。并对 线粒体基因组进行了No．hem杂交分析，发现体细胞杂种线粒体表达量高于融合亲本， 而胞质杂种与亲本之间无明显差异。 7、根据黑松(Pinus thunbergii)、水稻(Oryza sativa)、烟草(Nico“ana tabacum)和拟 VI 开展了以下研究： 1)选用34份柑橘及近缘属材料进行扩增，检测到等位位点的数目为l一8个，平 材料聚为7类：枸橼类、来檬类、柚类、宜昌橙类、金柑类、枳类和宽皮柑橘类。 南芥中引物原始模体序列进行比对，结果表明所有特异性扩增片段均来源于叶绿体基因 组，SSR是多态性产生的直接原因。 3)根据引物归类结果选择合适引物，对柑橘体细胞杂种的叶绿体基因组进行了分 析，所有组合都检测到多态性，进一步证实了柑橘原生质体融合过程中叶绿体的随机分 离，并且在金诺橘+锦橙，朋娜脐橙+构头橙等组合中检测到叶绿体呈1：1的分离。 4)应用这些引物对31种热带、亚热带果树的64份样品进行了初步筛选，得到了 一批通用性很强的叶绿体SSR引物，能在柑橘类、柿类，香蕉类、番石榴类、番木瓜类、 葡萄类等作物的近缘属或种间检测到多态性，为这些作物开展叶绿体SSR标记研究提供 了新方法。 8选取23份愈伤组织材料，以对应的田间叶片作对照，对它们在长期继代保存过 程中线粒体和叶绿体(质体)基因组进行了遗传稳定性的RFLP分析、组织切片观察、 cpSSR分析及线粒体向核基因组转移等研究。结果如下： 1)愈伤组织在保存过程中线粒体变异的几率很小，但线粒体DNA含量普遍增加， 而叶绿体(质体)基因组DNA含量无明显变化。 2)cpSSR分析发现，引物对SPCC4在愈伤组织中检测到比叶片多了一条谱带， Southern杂交和序列测定均表明，该谱带为特异扩增产物，说明愈伤组中质体基因组普 遍存在短核苷酸序列插入现象。 3)用线粒体探针与核基因组DNA进行斑点杂交，结果表明愈伤组织中线粒体基 因存在向核基因组转移的现象。 最后，综合以上所有研究结果，对柑橘原生质体融合过程中胞质基因组遗传与分离 的可能机理进