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分子生物学实验思考题答案 实验一、基因组DNA的提取 为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA? 答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的DNA片段. 用凝胶电泳看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断， 当OD260/OD280 1.8，表示蛋白质含量较高 当OD260/OD280 2.0，表示RNA含量较高 当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol 、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来 A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 在基因工程中将质粒导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+处理变为感受态细胞质粒进入。 活化培养用的一般是SOC培养基，这种培养基比LB培养基营养，此时进行的活化培养只是为了让大肠杆菌迅速复苏，恢复分裂活性，此时的细胞还不具抗性，加入抗生素会细胞会死亡。 质粒是细菌体内的环状DNA分子。质粒也是作为细菌遗传载体的一部分，但通常其携带的基因对细菌而言必要性要比核内DNA的小很多。比如，抗性基因，荧光蛋白基因等等。根据质粒随细胞分裂而分裂的次数，将其分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。常用于基因重组的质粒是pBR322质粒，因为其基因测序已经完成，而且它携带了两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因Apr，另一个是四环素抗性基因Tetr。 变性所需的加热温度取决于模板及 PCR 产物双链 DNA 中的 G+C 含量。 双链 DNA 中的 G+C 的比率越高，则双链 DNA 分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与 DNA 分子的长度 相关，DNA 分子越长，在特定的变性温度下使双链 DNA 分子完全分离所需的时间就越长。 若变性温度太低或变性时间太短，则只能使 DNA 模板中富含 AT 的区域产生变性，当 PCR 循环中的反应温度降低时，部分变性的 DNA 模板又重新结合成双链 DNA，从而导致 PCR 的失败。非特异性条带数增多PCR 循环次数是否越多越好？循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 1、核酸的基础研究：基因组克隆 不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序 3、反向PCR测定未知DNA区域 4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA 5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控 6、cDNA末端快速扩增技术 7、检测基因的表达 8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学 答、G^AATTC EcoRI的识别序列和切割位点，粘性末端即：AATTC- CTTAA^G G- HindⅢ的识别序列为：A^AGCTT “^”为切割位点，黏性末端为：AGCTT- A- 用限制酶切割后得到的末端齐平就是平末端，一长一短就是粘性末端 用同种限制酶对含目的基因的DNA分子和运载体（如：质粒）进行切割，产生同种黏性末端（核苷酸序列），从而进行重组（加DNA连接酶），以导入目的基因。