分子试验手册.docVIP

一、样品的准备 采样准备：布袋，剪刀，手术刀，样品袋，液氮，以上东西需经过高压灭菌。 采样过程：采样时不要说话，佩戴乳胶手套，迅速采集小块组织装入样品袋或锡箔纸包装后，快速放入液氮，放时注意样品的充分冷却，回到实验室放入-70度。 注意采样时注意要迅速，以防RNA降解。 二、RNA提取 1、准备东西： 高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研钵、剪刀、镊子试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC（焦碳酸二乙酯）)水 ② 器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC水中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③ 无RNA酶灭菌水（DEPC处理过的水）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%（体积/体积）加入的DEPC处理过夜，拧松瓶盖，高压灭菌。80℃烘4h以上。 ④ Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥ 氯仿 ⑦ 异丙醇 操作步骤Trizol法提取总RNA ① 先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ② 室温放置5min，然后加入200μl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。 ④ 小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤ 重复步骤④。 ⑥ 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μl DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴 10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 [注意] ① 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 ② 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。RT-PCR扩增目的基因cDNA试剂 ① RNA模板 ② Olig（dT）18 ③ 反转录缓冲液 ④ dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦ Pfu DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶 ⑧ 10×PCR buffer ⑨ 特异引物（PCR） 设备 PCR扩增仪、电泳仪、台式离心机、恒温水浴、微量移液器操作步骤 3.1 RNA的反转录 ① 在小EP管中依次加入 RNA模板 3 μl Olig（dT）18引物 1μL DEPC H2O 8 μL 混合后，70℃水浴5 min（破坏二级结构），再冰浴5min② 在管中依次加入 (反应体系为20 μL)： RT 5×buffer 4μL RNasin 1μL dNTP ( 10mM) 2μL 混匀，37℃ 5min。 M-MULV反转录酶 1 μL 置于 42℃，1h。 ③ 70℃保温5min（使酶失活）。 ④ 于-20℃保存备用。 3.2 PCR扩增目的基因 3.2.1 用克隆引物扩增目的基因 在灭菌的PCR管中，依次加入 模板（反转录产物） 1μl 10×PCR缓冲液 3μl dNTP 0.5μl 克隆引物B1 1μl 克隆引物B 2 1μl Pfu DNA聚合酶 0.5μl dd H2O 23μl 混匀后按下面的设置程序进行扩增。 94 ℃ 3 min 94 ℃ 45Sec 30 cycles: 55 ℃ 45Sec 72 ℃ 45Sec