棉蚜杀虫剂神经靶标分子生物学研究.pdfVIP

284 昆虫学创新与发展 棉蚜杀虫剂神经靶标的分子生物学研究 李 飞 韩召军’ (南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室 南京210045) 摘 要 以杀虫剂的三大作用靶标 (乙酞胆碱醋酶、乙酸胆碱受休和钠离子通道)为研 究对象，开展了棉蚜杀虫剂神经靶标的分子生物学研究，主要包括杀虫剂靶标的基因克隆、 序列分析、同源结构模拟、系统进化分析和害虫抗药性的分子监测技术的研究。对杀虫剂 靶标的基因结构与功能的深人了解将进一步揭示杀虫剂抗性形成的分子机理，以及神经靶 标与杀虫剂之间分子水平的相互作用，从而危害虫抗药性监测与治理和农药的分子设计提 供理论基础。 关键词 棉蚜 杀虫剂 神经靶标 乙酞胆碱醋酶 乙酞胆碱受体 钠离子通道 昆虫的神经系统中已经开发的杀虫剂靶标位点相对较少。绝大多数商业杀虫剂都作 用于乙酞胆碱醋酶 (AChE,EC.3.1.1.7)、钠离子通道、乙酞胆碱受体 (nAChR)和氯 离子通道等靶标中的某一种。在一定程度上，正是过多地依赖于仅有的靶标位点所带来 的选择压力，导致了害虫抗性的爆发和交互抗性的产生。由变构乙酸胆碱醋酶导致害虫 对有机磷类和氨基甲酸醋类杀虫剂的抗性，钠离子通道的突变则对拟除虫菊酷类杀虫剂 产生高水平的抗性(kdr或。uper-kdr)，这已有大量的报道’一〔’，一‘iol。近年来在防治刺 吸式害虫上，新型的氯化烟碱类杀虫剂— 毗虫清和毗虫啦等以其高效、高选择性和独 特的生化性质在大田得到推广使用。迄今为止，尚未有变构乙酞胆碱受体的相关报道， 但仍然引起了人们对其作用靶标乙酞胆碱受体的广泛兴趣[4-eJ 随着杀虫剂抗性研究的不断深人，人们已经能够利用生物测定、生化毒理学和酶学 以及分子生物学技术检测害虫的抗药性程度及研究相应的抗性机制。然而，对于杀虫剂 靶标的基因结构及其与农药互作的分子机理，却知之甚少。本文利用我国重要的棉花害 虫棉蚜 (AphisgossypiiGlover)为研究对象，开展了对乙酞胆碱酷酶、钠离子通道和乙酞 胆碱受体的基因克隆、序列和系统进化分析，以及拟除虫菊醋类杀虫剂靶标抗性分子监 测技术的研究。 1棉蚜2个乙酞胆碱醋酶基因的克隆 在脊椎动物中，通常具有2种胆碱醋酶:乙酸胆碱醋酶和丁酞胆碱醋酶 (BuChE, EC.3.1.1.8)。但在抗性研究中发现，虽然在抗性果蝇和家蝇品系的乙酞胆碱醋酶中， 存在4个突变位点 ((5个突突)与其对有机磷类杀虫剂的抗性形成有关t?一}“。然而对微 小牛蝉，黑尾叶蝉和棉铃虫的研究却未能在抗性品系的乙酞胆碱酷酶中找到与抗性相关 的突变。对此，研究工作者提出了2种假设来解释害虫乙酞胆碱醋酶敏感性下降的原 。通讯作者 药 剂 毒 理 285 因:乙酞胆碱MR酶基因的翻译前调控或存在第2个乙酞胆碱醋酶基因。在库蚊乙酞胆碱 醋酶的研究中，Bourguet等利用梯度离心和电泳技术证实库蚊可能存在2种不同底物特 异性和电泳迁移特性的乙酞胆碱醋酶[川。本文采用RT一PCR技术、简并引物和RACE 技术相结合的策略，从棉蚜中克隆了2个乙酸胆碱醋酶基因。 11棉蚜2个乙酞胆碱酝酶基因 从棉蚜中克隆了2个乙酞胆碱醋酶基因，分别命名为acel和ace2。其中acel基因 全长为2371饰，开放阅读框为2031饰，编码676个氨基酸。Ace2基因全长为21306p，开 放阅读框为1992bp，编码664个氨基酸。aceI和ace2基因的GeneBank登录号分别为: AF502081和AF502082。克隆获得的2个ace基因具有乙酞胆碱醋酶基因家族的保守性特 征，并与其他昆虫的乙酞胆碱醋酶具有很高的相似性。其中acel与麦二叉蚜乙酞胆碱 酷酶基因的相似性达95%，而ace2与桃蚜乙酞胆碱醋酶的相似性达92%. 1.2棉蚜乙酞胆碱醋酶基因的同源结构模拟 利用SWISS一Model服务器，分别以电鳃和果蝇乙酞胆碱醋酶的晶体衍射三级结构 为主要模板，对克隆获得的2个乙酞胆碱醋酶基因进行同源结构模拟。结果发现，棉蚜 中的2个乙酞胆碱醋酶基因可能存在不同的三级结构 (图1)0 图1棉蚜2乙队胆碱酣酶的同谭结构棋拟。以电绍和果姐乙珠胆碱两醉的