蜂毒素与基因变构人白细胞介素-2融合基因原核质粒构建、表达、纯化及活性测定.pdfVIP

蜂毒素与基因变构人白细胞介素-2融合基因原核质粒构建、表达、纯化及活性测定.pdf

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摘要 目的构建免疫毒素——蜂毒肽与变构人白细胞介素.2融合基因的原核表达质 粒;并通过对其诱导表达而探讨其对宿主菌E.coll.生长的影响,筛选稳定表达宿主 菌株,表达发酵,目的蛋白定位分析;对可溶部分进行纯化,得到目的蛋白;研究 经Nco 不同时间宿主菌的OD600值并绘制生长曲线及对诱导不同时间的宿主菌进行活菌计 数;28℃,lmM 化,BCA法进行融合蛋白浓度测定。用液相测定法研究融合蛋白的抑菌活性,用 MTr法研究融合蛋白对外周血单个核细胞增殖和对Hela细胞生长抑制的作用。利 用方差分析处理数据。结果目的片段长542bp,测序分析重组子如预期突变,无缺 失、插入及框移;ELISA检测到目的蛋白表达。重组子诱导表达两小时宿主菌OD600 有表达;对可溶部分初步纯化后,每升菌液可得融合蛋白62/比g。纯化后的融合蛋白 抑菌率呈浓度依赖性;对外周血单个核细胞增殖作用与IL-2的差异不具有显著性(P 杀伤作用,质粒丢失情况严重;筛选出变异的耐受宿主菌株,可以进行稳定表达; 对表达产物的可溶部分进行纯化,得到了M.IL-2(踯Arg)免疫毒素融合蛋白;该免 疫毒素融合蛋白具有抗菌、增强免疫功和抑制恶性肿瘤细胞增殖等良好的体外生物 学活性。 硕士研究生 郑旭(病原生物学专业) 导 师 王斌教授 关键词:免疫毒素;蜂毒肽;白细胞介素一2;原核表达;活性 Abstract construct To vector it. Objective expression identify Screenhostcellswherethe can target induction, gene expressstably,followedby and determination.Thenactivitiesoftherecombinantin purification investigate protein vitro.Methods the mutant Using pGEX一4T-2/Melittin-IL-2(8sArg)astemplate,a obtainedPCR Melittin.IL-2(8SArg,125Ala)Wasby point constructed 125Ala)was byligationpET.32a(+)and NcoI and followedtheT-A constructWas digestedby HindlIl,which cloning.The withDNA identified WasrunwhentheconstructWastransformed sequencing.Induction to thetotal Was ELISA.The ofhost BL21(DE3),andproteinanalyzedby growthcurve celldrew hostcellsWasdeterminedonthemed

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