小鼠胚胎干细胞来源的树突状细胞骨髓瘤疫苗功能性研究.pdfVIP

小鼠胚胎干细胞来源的树突状细胞骨髓瘤疫苗功能性的研究 pIl37． 沈冬 贵州省贵阳医学院附属医院儿科 (贵阳550004) stem cell，ESC) 目的 (1)建立一个稳定、简便和快速的体外诱导小鼠胚胎干细胞(Embryonic cell，DC)的培养体系；(2)研究并比较小鼠胚胎千细胞来源和小鼠骨髓 分化为树突状细胞(Dendritic 细胞(Bone㈣w 鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合制备成肿瘤疫苗，进行动物抑瘤实验，观测疫苗疗效。方法I．1小鼠 养，连续传代。待细胞生长状态良好．种植至90ram rmGM— 养液；收获培养14天的胚体，种人90ram组织培养皿，20～30个胚体，皿。用含25ng／ml 去除红细胞，PBS洗3遍；用含mGM—CSF20ng／ml、／TElIL一420ng／ml、15％FCS的完全培养液调 24小时，得到成熟的13(2。1．3两种来源DC的鉴定以及功能比较倒置显微镜观察，透射电镜观 应。比较两种来源IX3刺激淋巴细胞增殖的能力。1．4两种来源13(3分别与肿瘤细胞融合制备疫苗 1．4．1肿瘤细胞的筛选肿瘤细胞用小鼠骨髓瘤细胞SP2／0(中山大学干细胞与组织工程研究 中心提供)。融合前2周。用8一AG(8一氮杂鸟嘌呤)筛选，确保细胞对HAT的敏感性，防止细胞突 时后，弃去培养液(除去非贴壁细胞)，改为HAT+生长因子培养液培养，常规换液，待未融合的SP2／ 0基本死去，改用HT+生长因子培养液维持2周，最后用含生长因子的诱导培养液培养，抗原刺激 成熟后可收获融合细胞。1．5两种来源DC融合疫苗体外CTL活性测定分别将两种来源DC融合 疫苗与小鼠淋巴细胞混合培养，激发产生细胞毒性T淋巴细胞(Crh)，作为效应细胞。取对数生长 述ES来源的融合细胞活疫苗；2)上述BM来源的融合细胞活疫苗；3)PBs对照。上述各组小鼠处理 后5天，臀部皮下接种活的SP2／o细胞106个，观察各组诱发骨髓瘤的情况。评价比较两种来源13(2 疫苗的作用。1．7两种来源13(3融合疫苗的免疫治疗作用1．7．1荷瘤小鼠模型的建立收集 疫苗的免疫治疗作用待肿瘤体积生长至5×5×5m叠时，各组小鼠再经尾静脉分别注射如下物 各组荷瘤小鼠的生存期以及肿瘤生长情况，评价比较两种来源13(2疫苗的作用。1．8统计学处理 采用未配对资料的t检验。结果 2．1两种来源IX3的诱导、鉴定及功能比较Es细胞在无 LIF的条件下悬浮培养，自发地分化。培养4～5天即可见单个的胚体，圆形或类圆形，大小较为一 致。且在以后的10天内继续长大，达几毫米。收获胚体转至组织培养皿，加含细胞因子的培养液贴 壁培养；培养4--5天时，在大多数的胚体开始观察到DC，这些细胞围绕胚体外周生长，形成一圈明 亮的光环．且随时间迅速扩增，成簇生长。培养7天以后。IX；迁移至克隆之间空旷的地方继续增殖， 将其暴露于LPS后，可见IX；漂浮生长，具有广泛的突起和毛刺。与经典骨髓来源成熟IX；相似；透 别与肿瘤细胞融合，融合第二天弃去培养液，去除非贴壁的细胞，剩下贴壁生长的融合细胞和SP2AI 细胞，用含HAT的培养液培养一段时间后，肿瘤细胞死去，剩下较纯的融合细胞，形态及功能与IX： 相似，与野生型肿瘤细胞相比增殖明显缓慢。收获融合细胞即得活疫苗。2．3 两种来源DC融合 疫苗体外CTL活性测定两种来源融合细胞在体外均能诱导出一定的针对野生型肿瘤细胞的特异 性CTL活性，且杀伤活性无显著差别。2．4两种来源IX；融合疫苗的免疫保护作用1组及2组 经过尾静脉注射融合细胞活疫苗，受到肿瘤细胞攻击后，观察60天未见肿瘤形成；3组PBS对照组 见有肿瘤形成，结果显示疫苗组与对照组差异显著。2．5两种来源DC融合疫苗的免疫治疗作用 1组及2组两种融合疫苗治疗组，荷瘤小鼠的瘤体生长速率明显减慢，呈膨胀性，有包膜，无远处转 移，小鼠生存期明显延长。但两组比较无显著性差异；3组PBS对照组小鼠肿瘤呈恶性生长．瘤体生 长速度快，生存期与其他2组相比有显著差异