丝状真菌细胞凋亡研究方法.pdfVIP

Mycosystema 菌 物 学 报 15 May 2008, 27(3): 474-481 jwxt@ ISSN1672-6472 CN11-5180Q ©2008 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved. 丝状真菌细胞凋亡研究方法 * 林琳 姜俏 汪天虹 山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 250100 Research methods for apoptosis of filamentous fungi * LIN Lin JIANG Qiao WANG Tian-Hong State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China 细胞凋亡作为细胞调控机制之一，与细胞增殖、细胞分化同等重要，在进化上具有保 守性。细胞周期和凋亡通路的失调能引发多种人类疾病，是目前生命科学领域活跃的研究 方向（Gougeon 2003 ；Brown Attardi 2005 ）。由于丝状真菌细胞凋亡的表型和生理特征 与动物细胞相似，而且细胞结构和代谢过程简单，用作模式生物既可以简化凋亡模型又可 以探究凋亡核心通路。因此，掌握丝状真菌细胞凋亡的检测方法非常必要。丝状真菌细胞 结构与动物细胞不同，使丝状真菌细胞凋亡在检测方法和步骤上具有独特性。例如：凋亡 时，丝状真菌细胞原生质体凝缩并产生大量液泡，利用该表型特点可对细胞凋亡进行初步 判断（Fröhlich Madeo 2000 ）。在进行凋亡鉴定时，染料不容易透过丝状真菌细胞壁，因 此需要制备原生质体或进行菌丝原位破壁。原生质体通常来源于不同生长时期的菌丝，其 菌龄、活力、生长状态等都不同，因此如何表征原生质体活力将成为下一步研究的重点。 与酵母类似，在丝状真菌凋亡过程中没有发现 DNA ladder 现象，需要通过其他方式鉴定 DNA 片断化。本文对开展丝状真菌细胞凋亡研究时常用的检测方法，包括其原理、特点、 No.No. 973 No. 2003CB716006 No. 基金项目：国家自然科学基金（ ， ）；国家重点基础研究规划项目（ ）（ ， 2004CB719702 ） * Corresponding author. E-mail: wangtianhong@ 收稿日期：2007-09-21，接受日期：2007-11-27 Vol.27 No.3 475 操作步骤，以及相对于哺乳动物细胞凋亡检测方法的改进等诸方面进行了阐述。 1 菌丝生长与活力检测 凋亡作为一种细胞死亡过程，检测细胞生长（ ）和活力（ ）是研究的必 growth viability 要准备。与动物细胞类似，真菌细胞活力检测常用的方法有伊文思蓝（Evans blue ）染色， 噻唑蓝染色（MTT ），平板计数法（Colony forming unit，CFU ）等，其中平板计数法是最 可靠的方法。 伊文思蓝（Evans blue ）是一种检测细胞死活的染料。其原理在于伊文思蓝不能透过 健康细胞的完整细胞膜，但当细胞死亡时能够渗入破损细胞膜染色。Chen Dickman （ ）使用该方法检测了脯氨酸对三叶草刺盘孢 凋亡的抑制作用， 2005 Colletotrichum trifolii 在缺乏脯氨酸的基本培养基上诱导显性活化致癌基因 （