光学显微镜制片技术_百替生物.pdfVIP

光学显微镜制片技术 technique for microscopical slides 将生物材料制成适于在下观察的薄片的技术。新鲜的生物材料虽然用简单的方法做成临时制片也可 观察，但为了保存以备以后的观察，常需按一定步骤制成永久制片。 显微制片首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免膺像、变形和失真,因此须将生物材料做固定 处理;制片必须薄而透明，才能在下成像，除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外，还 需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地观察到结构的细节。需长期保存的制片，还应进行脱水 和封固。 显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4 大类。 切片法 光学显微镜的切片厚度在 2～25 微米之间，一般动植物材料的切片以厚10 微米左右为合 适。切片法根据包埋剂的不同而有所不同。最常用的是石蜡切片法，它适用于一般生物材料。棉胶切 片法，把生物材料经棉胶包埋后切片。适用于特别坚硬的材料或特别柔软而体积大的材料（如完整的 大脑）。冰冻切片法，将生物材料在一定的介质中冰冻固化后切片。适用于研究活体标本或作组织化 学的研究。乙二醇甲基丙烯酸脂法（简称GMA 法）,适用于制作1～3 微米厚的切片。石蜡切片法包 括固定、包埋、切片、染色、脱水和封固等步骤。关键是把生物材料用石蜡包埋，以石蜡为支持物， 把浸在蜡块中的生物材料切成理想的薄片。操作过程为：固定→水洗→从低浓度逐级到高浓度酒精脱 水→二甲苯透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→二甲苯脱蜡→逐级从高浓度到低浓度酒精处理，最后过 渡到水→染色→逐级从低浓度到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→树脂胶封固。其中的基本步骤在各种 制片技术中都是相同的。 固定 用物理的或化学的方法将生物材料迅速杀死、使蛋白质变性和凝固，达到保持细胞的形状和 内部结构的目的。物理固定法常用冷冻处理或火焰烘烤。化学固定法，主要是把生物材料迅速浸泡在 固定剂中。固定剂常是含有几种化合物的混合液，既有强烈凝固蛋白质的化合物，也有非凝固性的化 合物，它们对蛋白质起交联和稳定作用，即所谓“鞣化作用” 。已有的一些比较理想的固定剂,大多以最 初设计者命名（表 1[显微制片中常用的一些固定 剂] ）。 脱水和透明 固定之后，一般须用水冲洗材料移去多余的固定液。为了使材料能为石蜡所浸透，必 须将水移去，换成能溶解石蜡的有机溶剂，如二甲苯等。在制片中常用的脱水剂是乙醇（酒精），将 浸在水中的材料依次移入从低浓度到高浓度的乙醇中，最后移到纯乙醇中完成脱水。然后将脱水后的 材料移入二甲苯中。 service@100 浸透和包埋 在温箱中用溶化的石蜡取代二甲苯。使材料逐步为纯石蜡所浸透，然后将材料连同熔 化的石蜡，倒入小纸盒中，在室温下或在冷水中使包埋有材料的蜡块迅速凝固。浸透和包埋的目的是 使材料藉石蜡的支持能被切成薄片。 切片 将包埋好的材料用切片机切成薄片。切片机有轮转式切片机（图 1 [轮转式切片 机] ）和滑行式切片机 （图2 [滑行式切片机]两种。切片机一般用专门的钢刀。包埋材料的蜡块边缘要整齐，使被切下的蜡 片前后能自然地连接，形成蜡带，有利于制备连续切片。切片后，将蜡带或单个蜡片贴在载玻片上。 染色 先将已粘贴有蜡片或蜡带的载玻片，在染色缸中经二甲苯脱蜡，再经过一系列从高浓度到低浓 度的酒精而过渡到水中，即可染色。生物染料种类繁多，用途各异，可区分为碱性染料和酸性染料两 大类。碱性染料为一种色碱盐，可染细胞核，如苏木精、甲基绿和番红等。 service@100 酸性染料为一种色酸盐，可染细胞 质或核以外的其他成分,如伊红、橘红G 和固绿等。碱性染料和酸性染料混合后称中性染料，也称复 合染料，如芮氏染色剂和姬姆萨染色剂等。染色可只用一种染料，但通常采用复染，例如：先染碱性 染料显示核，再染酸性染料显示其他结构。染色的深浅，随材料的不同和浸染时间的长短而不同，因 此要达到合适的程度常需要进行分色，即先过度染色,再使其褪色,当达到合适的程度后即中止。显微 制片中采用何种染色方法