mRNA差异显示技术及其在寄生虫学研究中的应用.pdfVIP

维普资讯 动物医学进展 。2007，28(5)：6卜65 ProgressinVeterinaryM edicine mRNA差异显示技术及其在寄生虫学研究中的应用 王运宏 r一，孙延鸣 ，薄新文 (1．石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2．新疆农垦科学院 新疆生产建设兵团绵羊繁育生物 技术重点实验室，新疆石河子 832000) 摘 要：mRNA差异显示技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一。该技术 以其简便、灵敏和 RNA用量少，且可同时比较多组样品等优点成为 目前该领域 中最受青睐的技术之一。但 是 ，该技术也存在假 阳性率高、所得差异片段较短等诸多不足。针对这些缺 陷，人们在 引物的设计 、PCR循 环参数的优化、阳性克隆的鉴定等方面进行了改进 。文章就该技术的原理、优越性、主要缺点、技术改进及其 在寄生虫学研究中的应用方面进行了综述。 关键词：mRNA差异显示；聚合酶链反应；寄生虫学 中图分类号：Q753；$855．9 文献标识码：A 文章编号 ：1007—5038(2007)05—0061—05 生物的性状和对各种环境 因子 的响应 ，本质上 PCR技术的基本原理、主要优缺点、技术改进及其 都是基因差异表达 的结果[1]。研究基 因差异表达 的 在寄生虫学研究中的应用做一综述。 技术有多种，但大都是建立在 2O世纪 8O年代中期 1 mRNA差异显示 PCR技术原理 出现的PCR技术基础上 的。1992年 ，美国哈佛医 D)【-PCR是根据大多数真核生物 mRNA3末 学院学者 LiangP等[2首次提 出了一种全新 的显示 端都有 poly(A)尾，选取不同的组织样品或不同发 mRNA差异表达 的方法 ，即mRNA差异显示 PCR 育阶段的同一组织样品或同一组织样 品经不同药物 (utRNA differentialdisplayPCR，DD-PCR)，应用 处理诱导的样品，经总RNA提取后，设计一套锚定 该技术对 比人类乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞所 引物 Oligo-dT12MN(M，N 表示 4种碱基 中的 1 表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因。 种，M=A／C／G，N—A／C／G／T，共 12种引物)，利 ErricHaay等(1994年)将这种方法正式命名为差 用该锚定引物进行 mRNA反转录合成 cDNA。并 异显示反转录一聚合酶链反应 ，简称 DD-PCR。至 用此引物和 5端的随机引物对逆转录产物 PCR扩 今，该技术经过2O余年的发展，已成为筛选差异表 增，对PCR产物进行凝胶 电泳，随后进行荧光染色 达基因的一种最为有效的方法 。运用mRNA差异 或硝酸银染色或放射 自显影，通过比较找出差异表 显示技术分离鉴定 的差异表达基因的报道也逐年增 达的cDNA条带[3]。对于相同的cDNA，PCR产物 加，研究体系也从简单的单细胞到高等的哺乳动物， 的种类和分布应该是完全相同的。将凝胶上有差异 几乎涉及到整个生命活动的研究。DD-PCR已经成 的条带切下来再进行 PCR扩增，克隆所得的PCR 功地应用于动物及人类癌症、心脏病、糖尿病、胚胎 产物作为探针对样品进行Northernblot分析，以验 发生、脑发育、生长因子激活与抑制有关的基因的鉴 证该 cDNA是否真正差异表达 ，并进一步推测其相 定与克隆。此外，该技术也成功地应用于与植物胚 应的功能。从理论上讲，如选用足够 的不同引物组 胎发育、无融合生殖、形态发生、果实发育、信号传 合，可检测到细胞 中所有基因的表达情况。 导、植物抗逆与抗病性及植物与真菌有关的基因的 该技术基本步骤如下：①提取不同细胞 (或组 比较鉴定和克隆，并且 DD-PCR也随着这些领域的 织)的总RNA。② 以TllMN或 T12MN为引物进 研究，实验方法得以不断改进，克服了以往实验过程 行逆转录。③第一次PCR扩增。④通过电泳、放射 中诸多缺点，越来越成为一种成熟的实验方法。但 自显影找出差异的cDNA，回收并进行第二次扩增。 是，利用mRNA差异显示技术鉴定寄生虫发育调控 ⑤Northern杂交，验证 目