王勇生--北京鸭生长激素受体基因cDNA部分序列的克隆及表达研究.docVIP

北京鸭生长激素受体基因cDNA部分序列的克隆及其在 胸肌组织表达的研究 王勇生 摘 要 ：试验成功克隆北京鸭GHRcDNA 345bp的部分序列，共编码114个氨基酸。编码氨基酸的保守域分析表明GHR编码的蛋白含有FN3结构域。在北京鸭7、14、21、28、35、42日龄胸肌组织都可检测到GHR mRNA 的表达，但各日龄间GHRmRNA表达丰度值之间差异都不显著（p0.05）。北京鸭胸肌组织内GHR的表达与北京鸭的胸肌生长速度没有相关性。 关键词 北京鸭；生长激素受体基因；克隆；表达 中国分类号： 文献标示码： 文章编号： 生长激素(GH)是腺垂体分泌的具有广泛生理功能的生长调节激素，其功能有代谢效应、增殖效应和分化效应，主要作用是促进机体生长，促进合成代谢（张逊，1999；张镜如，1998）。生长激素对机体生长、发育的促进作用，主要从肌肉、脂肪和骨骼三方面表现出来，在哺乳动物如猪中，GH通过对营养物质向不同组织的分配等途径来调控肌肉、脂肪的发育（Hodik，1997，Vasilatos-Younken，2000）。GH在组织和细胞水平发挥作用的第一步是和靶细胞膜表面的rowth hormone receptors，GHR）结合,由GHR介导将信号传入细胞内从而产生一系列的生理效应。组织中GHR量的多少、功能的正常与否将影响GH生理效应的发挥。urnside等，1992；Mao等，1998；高 萍，2005）；而关于GHR基因在鸭不同组织中表达的研究还未见报道，因此本试验对鸭GHR基因部分序列进行了克隆，并对鸭GHR基因在北京鸭胸肌组织表达特点进行了研究，以期为GH、GHR基因对北京鸭胸肌发育调控的研究提供基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品 分别取7、14、21、28、35、42日龄北京鸭公鸭胸肌样品，液氮速冻后放入-80 ℃冰柜保存，备用。 1.1.2 引物设计 （1）根据鸡GHR基因序列（GenBank收录号[收稿日期] [基金项目] 国家“十一五”农林动植物育种专项“优质肉鸭新品种选育（2006BAD01A09） [作者简介] 王勇生（1975-），男，宁夏中宁人，助理研究员，主要从事水禽育种研究。 [通讯作者] 上游：5’-TTACTTCAACACATCCTACACC-3’ 下游：5’-TCATAATCTCTTCCCATCTTCA-3’ 引物由北京奥科生物技术公司合成。 （2）北京鸭胸肌组织GHRmRNA表达丰度检测内标基因β-actin扩增引物。参照Ruqian Zhao等[11]报道的序列设计内标基因β-actin的扩增引物： 上游: 5’- ACGTCGCACTGGATTTCGAG -3’ 下游: 5’- TGTCAGCAATGCCAGGGTAC -3’ 引物由北京奥科生物技术公司合成，预期扩增片段长度为282 bp。 1.1.3 试剂 pMD-18T载体试剂盒、反转录试剂盒、内切酶 EcoR V 和Pst I 购自大连宝生物公司；Trizol试剂盒、质粒提取试剂盒、DH5α感受态细胞、DNA marker等购自北京天为时代公司；DNA回收试剂盒、琼脂糖购自北京博大泰克生物技术公司；琼脂粉、胰蛋白胨酵母提取物rizol 试剂盒使用说明书进行。 1.3 北京鸭 RNA的RT-PCR 1.3.1 RT反应 北京鸭 RNA的RT反应参照反转录试剂盒使用说明书进行，反转录产物立即进行PCR扩增或放于-20 ℃保存备用。 1.3.2 GHR cDNA 部分序列及内标基因β-actin的PCR 扩增 PCR扩增反应体系参照反转录试剂盒使用说明书进行。扩增条件均为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，51℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共30个循环;最后72 ℃延伸1O min。扩增产物用20g/L的琼脂糖胶电泳检测。 1.4 RT-PCR产物的回收及测序 用DNA回收试剂盒回收RT-PCR产物，将回收产物与pMD-18T载体连接，转化DH5α感受态细胞，接种转化后的DH5α感受态细胞于含有氨苄青霉素、IPTG、X-gal的LB固体培养基上，37 ℃培养12-16 h后挑取阳性菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃ 160 r/mim培养过夜；对菌体进行PCR鉴定，同时提取质粒，用EcoR V和Pst I进行酶切鉴定。将PCR和酶切鉴定均为阳性的细胞送北京博雅生物工程公司测序。 1.5北京鸭GHR cDNA 部分序列生物信息学验证分析。 利用GenBank在线Blast软件对北京鸭GHR cDNA部分片段的核苷酸序列与推测的氨基酸序列进行生物信息学验证分析，并分析编码氨基酸的保守区域。