细胞因子的分子生物学检测法.docVIP

细胞因子的分子生物学检测法 ? ??? 细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达水平的检测。特定细胞因子mRNA表达水平的检测有助于判断细胞表达该细胞因子的水平；而细胞因子DNA的检测可以判断该细胞因子基因存在与否及其变异情况。常用的方法有Southern印迹、斑点印迹、PCR，原位杂交及原位PCR等，Northern印迹及RT-PCR。这里简要介绍常见细胞因子mRNA表达水平的检测。 ? 一、斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量 ??? 本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。该法先将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上，可用手工操作点样，也可用斑点式点样器点样，再与特异性探针进行杂交。由于其操作比Northern印迹简单、迅速、所需样品量少，且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测，故很适合于临床应用。亦可用于DNA的检测。但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。 下面以检测培养细胞的IL-2 mRNA含量的检测，说明斑点杂交法的操作过程。只要改变相应的DNA探针，此方法也适用与其他细胞因子mRNA含量的检测；或者改变RNA的提取方法，也适用于其他类型细胞的检测。 ? 二、原位杂交法测定TNF的mRNA ??? RNA-DNA原位杂交的原理与分子杂交其它方法的原理相同。但是其它方法都是将RNA提取出来后进行分子杂交，而原位杂交则是在细胞内mRNA原有位置上进行杂交，细胞则尽可能保持原有形态。将细胞以适当方法固定后，除去脂类并适当消化细胞内的蛋白质，增大细胞对大分子物质的通透性，使DNA探针便于出入细胞。与免疫组化相结合，原位杂交可以将显微镜下的组织形态学资料与DNA，mRNA，蛋白质水平的基因活动联系起来。进行分子杂交之后，将玻片上细胞置与显微镜下观察，可确定不同细胞内的基因表达定位情况。 ? 三、反转录PCR(RT-PCR)定量检测细胞因子的mRNA ??? 细胞因子的mRNA寿命短且拷贝数低，因此难以在小量样本中进行检测。RT-PCR是一种能检测细胞内低丰度特异RNA的方法，其原理是首先以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成与RNA互补的cDNA。然后以cDNA为模板，用PCR技术对靶序列进行扩增，使微量细胞因子的RNA经放大后检出，常用的细胞因子引物见表8-1。RT-PCR能检出单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA，如同时放大内参照物（如表8-1中的b-Actin），即可对RT-PCR检出的细胞因子mRNA进行定量。 细胞内（胞浆）细胞因子的免疫学检测法 ? 【基本原理】 基本原理是应用荧光素标记的特异性抗细胞因子单克隆抗体，借助FCM免疫荧光技术（如FACS）即可从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子，并由此可判断产生特定细胞因子的细胞种类、细胞定位，分布密度及细胞因子与组织病变的关系等。也可将细胞裂解后，应用ELISA、RIA等技术检测细胞与细胞因子水平。现以FCM免疫荧光法检测人PBMC内的细胞因子为例加以简单介绍。 【操作步骤】 （1）???人PMBC：常规分离人PBMC，用含10%小牛血清，50μmol/L 2-巯基乙醇、1mmol/L丙酮酸钠的RPMI-1640完全培养液将PBMC调浓度为2×106/ml； （2）细胞培养与收集：取6孔细胞培养板，加上述细胞悬液，2ml/孔，并加入2μmol/L莫能菌素（monensin，抑制细胞分泌细胞因子）、1μmol/L艾罗雯素（ionomycin）和20ng/ml PMA丙二醇甲醚醋酸酯刺激细胞产生细胞因子。在37，5%CO2培养箱中培养适当时间，根据实验需要，可用不同方法刺激细胞诱导细胞产生细胞因子。用4PBS洗涤细胞1次，留下少许液体用于悬浮细胞，使细胞完全分散于离心管中； （3）细胞固定（可固定细胞内的细胞因子）：于每管中加入4%多聚甲醛（用PBS配制，置37预温）3ml，充分混悬细胞，固定5min。再加入0.1% BSA-PBS 12ml，混匀以终止反应。1500r/min离心10min，去上清液后进行封闭和染色；亦可用lml含10%DMSO（二甲亚砜）的PBS悬浮细胞，分装保存于-80冰箱备用； （4）封闭非特异性结合位点：取上述固定的细胞（或复苏冻存的细胞，用0.1% BSA-PBS洗涤细胞2次），用悬浮液（含5%脱脂奶粉的PBS-Ca-Mg: lmmol/L Ca2+、lmmol/L Mg2+、 0 .1%皂角苷和0.1%BSA的PBS）悬浮细胞至106/100μl。室温下作用1h，封闭非特异性结合位点，并增加细胞膜的通透性，以利于荧光素标记的抗细胞因子单克隆抗体能进入细胞内与胞浆中的细胞因子特异性结合。取96孔塑料软板或 V型底离心管，每孔（管）加入上述细胞悬液20μl，离心去上清。用悬浮液稀释不含特异性抗体的