2012级药学本科实验2.pptVIP

Part I 免疫标记技术 ----间接法ELISAPart Ⅱ 免疫病理实验 ----超敏反应（录像） 潍坊医学院免疫学教研室 孙萍 TelEmail：myx@wfmc.edu.cn 免疫标记技术 免疫荧光技术 酶免疫技术 ELISA（酶联免疫吸附试验） 间接法----检测抗体 双抗体夹心法----检测抗原 抗原竞争法----检测抗原、抗体 放射免疫测定法（RIA） 免疫病理实验 间接ELISA法检测兔抗SRBC抗体的 原理、步骤、结果、分析 * 实 验 四 免疫标记技术 酶免疫技术 ELISA（酶联免疫吸附实验） 免疫病理实验 超敏反应 酶免疫测定法（EIA） 用酶标记的抗原或抗体进行抗原抗体反应，通过酶作用于底物后显色来判断结果的技术。 常用的标记酶： 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 常用方法 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原 （ELISA）可定性、定量、不能定位 酶免疫组化：组织和细胞中的抗原 （IHC） 可定性、定位 酶联免疫吸附实验 （Enzyme-linked Immunosorbent Assay ，ELISA） 【概念】 用酶标记抗原或抗体，将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的技术。 可敏感的检测体液中微量的特异性抗体或抗原。 Equipment for performing the ELISA test Pipettes Incubator ELISA reader 使Ag或Ab结合到某种固相载体表面，保持其免疫活性。 用酶标记Ag或Ab，同时保留免疫活性和酶活性。 将受检标本和酶标物质按不同步骤与固相载体表面物质反应，洗涤游离物质。 酶将底物催化，显色深浅与受检Ag或Ab的量成正比。 借助颜色反应的深浅来定性、定量Ag或Ab。 【原理】 间接法：最常用来检测抗体。 双抗体夹心法：最常用来检测抗原。 抗原竞争法：可检测抗原或抗体。 BAS-ELISA：提高实验敏感性。 【常用方法】 【原理】 Indirect ELISA to detect Ab (HIV, HCV) 间接ELISA 包被抗原，加待检的血清，再加酶标二抗，最后加酶的底物催化显颜色，颜色的深浅反映待检血清中抗体的量。 抗原 一抗 e e e 酶标二抗 加一抗 洗涤（洗掉未结合的一抗） 加酶标二抗（抗一抗的抗体） e e e e e e e e e e e e 洗涤（洗掉未结合的二抗） e e e e 加酶的底物（OPD） 底物（OPD） 酶将底物催化，显色 加H2SO4（终止液） H2SO4 （终止液） 间接法ELISA 【结果判断】 阴性 阳性 【实验器材】 抗原：脱纤维羊红细胞； 抗体：溶血素（兔抗羊红细胞抗体、一抗，同学们制备的免疫血清），酶标羊抗兔抗体（二抗）； 洗涤液，底物溶液（OPD），H2SO4（终止液）； 滤纸，温箱，湿盒，酶标板，酶标仪。 间接ELISA检测兔抗SRBC抗体 【大致步骤】 包被抗原 洗板，加入待检抗体（兔抗羊Ab、一抗） 洗板，加入酶标羊抗兔抗体（二抗） 洗板，加底物 加终止液 37℃孵育45min 37℃孵育30min 避光显色5min 1 2 取包被好的酶标板，充分洗涤3次。第一孔加入100ul洗涤液做阴性对照，第二孔加入100ul待检血清（兔抗SRBC 抗体，一抗），37℃孵育45min。 洗涤3次，每孔加入100ul酶标羊抗兔IgG（二抗）， 37℃孵育30min。 洗涤3次，每孔各加入酶底物100ul，避光显色5min，加一滴终止液（2mol/L的H2SO4）终止反应。 观察结果。 注意：洗涤应彻底！ 1 2 间接ELISA法检测SRBC抗体步骤 Part II 免疫病理实验 超敏反应 机体受到某些抗原刺激时，出现的生理功能紊乱或组织细胞损伤的异常适应性免疫应答。 分型 I 型 速发型超敏反应 II 型 细胞毒型/细胞溶解型超敏反应 III 型 免疫复合物型/血管炎型 IV 型 迟发型超敏反应 实 验 报 告 将两次次实验报告装订成册，一起交上 *