拟南芥CYP76C2(At2g45570)的克隆及其菌核病抗性分析.pdfVIP

2010中国博十后生命科学学术论坛 菌核病抗性分析 陈晓婷1，孙翠霞，王宗华 的过表达载体并获得转基因植株。通过离体和活体接种表明CYP76C2的过表达植株对核盘菌有抗性． [关键词]拟南芥；细胞色素P450；菌核病；草酸 拟南芥细胞色素P450基因占整个基因组的近0．6％，有273个基因，分别定位于五条染色 体上，其中41个基因功能已知【l】。植物细胞色素P450通过基因重复和保守进化形成一类庞大 的超基因家族，在植物体内担当着生物合成与代谢解毒途径两大功能。P450具有广泛的催化 活性和底物谱，在植物中目前已知的底物有数百种，包括脂类、苯丙烷类、黄酮类、萜类、 生物碱、生氰糖苷等内源性化合物以及包括农药、除草剂等在内的外源物质。涉及的反应机 制有羟基化、环氧化、杂原子脱烷基、双键氧化、杂原子氧化等弘J。在植物与病原物的长期 进化过程中，植物细胞色素P450通过各种代谢途径在体内形成各种抗病原物有关的物质。它 们有的作为毒素或杀虫剂，提高植物对病原物、昆虫等的抗性；有的则作为胁迫信号，活化 植物的抗病性Ⅲ。 前期实验发现草酸诱导CYP76C2的表达，本研究通过构建CYP76C2的过表达载体及从 ABRC获得的插入失活突变体研究CYP76C2对核盘菌(致病过程中能分泌草酸)的抗性，初 步了解该基因的可能功能。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1克隆载体、转化菌株及生化试剂 大肠杆菌(E．coli)DH5a、农杆菌(Agrobacterium 验室保存：pMDl8T 由本实验室保存。 PCR试剂(10XTaqBuffer、dNTP、rTaq、ExTaq)为大连宝生物T程有限公司产品； PCRiJI物由上海英骏公司合成；胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购白天根生化科技(北京) 有限公司；T．A克隆的重组质粒由上海英骏公司测序；T4 ligase、Ncol、XbaI购自纽英伦生 物技术(北京)有限公司。其它化学试剂从厦门泰京生物有限公司订购，均为分析纯。 作者简介：1陈晓婷，女，1968年12月生，福建农林大学生命科学学院化学生物系副教授，电话：0591E-mail： levtring(a——),126．com． 153 陈晓婷，等：拟南芥CYP76C2(At2945570)的克隆及其菌核病抗性分析 1．1．2植物实验材料 拟南芥(Col-O)，At2945570T—DNA插入欠活突变体SALK_037019C购白拟南芥生物资 源中心(ABI犯)。 1．2 实验方法 1．2．1基因组DNA、RNA的提取及半定量RT-PCR 拟南芥基因组DNA、RNA的提取：取3、4片6w龄的叶片，按文献【5】提取基因组DNA和 RNA。 first—strand for eDNA第一链的合成采用Invitrogen的SuperScriptTMsynthesissystem RT．PCR 试剂盒进行。 扩增CYP76C2和Actin2的引物为： AAACAAACA。 1．2．2 a停76C2的克隆 扩增CYP76C2的引物为：At2945570F-CATG￡￡篮≤i鱼ATGGAlATClATCTT 50 F 引物5’端添力HNcoI、劢口I酶切位点。以拟南芥基因组DNA ng为模板，以At2945570 min，94℃变性1min，55℃退 和At2945570R为引物，进行PCR反应。程序为：94℃预变性5 火1min，72℃延伸2min，30．33个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后， vector，转化DH5 回收纯化，连接到p