心肌肌钙蛋白I(cTnI)合成多肽与其抗体的研究.pdfVIP

心肌肌钙蛋白I(cTnI)合成多肽及其抗体的研究’ 张春明 王德芝 陈冀莹 秦丽莉 李玉彬 胡晓林 张欣 (中国医学科学院 中国协和医科大学放射医学研究所，天津300192) 急性心肌梗死(acute myocardial 率和死亡率正逐年增高，一直受到人们的密切关注。多年来筛选和寻找早期、特异、灵敏的 心肌损伤标志物以及简便、快捷的监测分析方法一直是人们研究探索的热点。心肌肌钙蛋白 I(cardiac tropominI，cTnI)作为心肌损伤标志物以其高度的器官特异性、高度敏感性及较长 的诊断窗口期，目前已成为国内外研究的焦点，正逐步取代CK—MB、LDH等传统的心肌酶 学指标，成为判断心肌损伤，特别是诊断心肌梗死的“金标准”u。]。目前国内临床上检测 cTnI所使用的试剂盒多为进口或进口原料国内组装，价格昂贵，既增加了患者的经济负担， 也限制了这一特异、灵敏的心肌损伤标志物的普及。此外，采用传统的方法从心肌组织中提 纯cTnI过程复杂，产率极低，同时心肌组织的来源和质量也难以保证，鉴于此，本研究根 兔制备相应抗体。为以国产试剂代替进口试剂，开发出具有自主知识产权的国产化的cTnI 检测试剂盒奠定基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1试剂。 人cTnI抗原 本室制备 人cTnT抗原 本室制备 人CK—MB抗原 美国sigma公司产品 福氏完全佐剂 美国life technologies公司 福氏不完全佐剂 美国life technologies公司 HRP一羊抗兔IgG抗体 卫生部北京生物制品研究所 微孔滤膜(O．45pm) 美国sigma公司产品 透析袋 美国sigma公司产品 顺丁烯酰胺一N一琥珀酸酯(MBS) 美国sigma公司产品 孑L蜮血蓝素(KIJq) 美国sigma公司产品 cTnI多肽(13肽) 由上海博亚生物技术公司合成 -基金项目：天津市科技攻关培育项目(项目批准号：043102211) · 184· 1。l。2实验动物：纯种新西兰雌性大耳自家兔购自中国医学科学院实验动物研究所。 1．2方法 1．2．1 cTnI多肽抗原的合成：根据NCBI 的13个氨基酸肽段序列作为抗原肽，应用全自动多肽合成仪，采用固相合成法由固定羧基 向氨基端递增合成，获得多肽粗品。经浓度为30％乙腈溶解后，进行HPLC分析，收集主峰 洗脱液，经冷冻真空干燥后获得合成肽纯品，进行质谱鉴定。 1．2．2 limpet c附合成多肽与载体的偶联：选择孔蜮血蓝素(keyhole 行偶联，操作步骤：①MBS的配制：取MBS用二甲酰胺(dimethyl KLH溶于0．5mlPBS中，置透析 度为15mg／ml(MBS／DMF)，临用前1小时内配制；②将5mg 袋内，用PBS于4。C下透析过夜，转入玻璃试管内；③加入MBS／DMF 709l，室温搅拌30分 合成肽溶于PBS中或溶于6mol盐酸胍／0．1mol／L P