早期生长反应基因-1在急性胰腺炎大鼠肝损伤机制中作用研究.pdfVIP

第四届全军肝胆外科会议暨2007肝胆外科论坛论文汇编 早期生长反应基因．1在急性胰腺炎大鼠肝损伤 机制中的作用研究 邹树田伏洲汤礼军黎冬喧汪涛石力崔建峰 成都军区总医院全军普通外科中心成都610083 【摘要】目的研究早期生长反应基因．1(Egr-1)在急性胰腺炎肝脏损害机制中的作用。 方法24只雄性wstaf大鼠随机分为4组，观察各组大鼠肝组织Eg卜1免疫组化染色结 蛋白表达情况。结果肝组织Egr-1表达与急性胰腺炎肝损伤程度呈正相关，且原代培养 肝细胞Eg卜1蛋白表达水平与肝细胞损害程度呈正相关。结论Egr-1可能参与急性胰腺 炎肝损害过程，并且其作用机制部分依赖于细胞外信号调节激酶1／2饵RKl／2)。 【关键词】早期生长反应基因一1急性胰腺炎肝损害有丝分裂素激活蛋白激酶类 重症急性胰腺炎病死率ij丁达25t精00％，炎性细胞因子“瀑布”样级联反应是导致其 高死亡率的主要原因之一[I】。研究表明早期生长反应基因一l(earlygrowthresponse gene一1，Eg卜1)通过与某些炎性细胞因子如TNF．a基因启动子上的特异序列相结合而导 致后者表达增加【2]，因而我们推测Egr．1在急性胰腺炎发病机制中可能具有某种作用。 本实验观察了Eg卜l在急性胰腺炎大鼠肝组织及原代培养肝细胞中的表达，并探讨了其 可能的信号转导机制，现将结果报告如下。 l材料与方法 Santa Cmz公司；大鼠TNF—q、IL．1BELISA试剂盒及n盯．仅购自晶美公司；DMEM 培养液购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司。 1．2大鼠急性胰腺炎诱导及分组24只雄性wistar大鼠，随机均分为4组，即A、B、 c、D组，分别剖腹逆行胆管内注射生理盐水、1％、3％及5％牛磺胆酸钠溶液(0．1mL，1009 BW)。 1．3肝组织E矿l免疫组化检测大鼠造模后3h，3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后剪开胸 腔，自主动脉分别灌注生理盐水及lo％中性福尔马林后取肝组织及胰腺组织。在灌注前 217 第四届全军肝胆外科会议暨2007肝胆外科论坛论文汇编 image 4．5进行半定量分析。胰腺组织常规石蜡切片，既染色。行病理评分。 pmplus 1．4大鼠肝细胞分离培养与处理根据文献【3】并略加改进从正常雄性wistar大鼠提取 肝细胞后，先以含lO％胎牛血清DMEM培养12h，然后换成无血清培养液饥饿培养24h。 取24瓶肝细胞，随机均分成4组，各组分别进行如下处理： I组：肝细胞+生理盐水lOoIll／ml培养液 Ⅱ组：肝细胞十大鼠TNF—al 01lg／ml培养液 ⅡI组：肝细胞+大鼠TNF一以Ong／Ⅱll培养液 Ⅳ组：预处理肝细胞+大鼠n盯一u20ng／ml培养液 其中Ⅳ组先用PD98059溶液预处理2h后。各组加入n悝一Ⅱ或生理盐水培养4h。留 取上清液用自动生化分析仪测AST及LDH。 1．5免疫印迹法检测原代培养肝细胞Egr-1蛋白的表达肝细胞如上处理4h后，以常 规方法进行肝细胞核蛋白提取，SDs一聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，并行免疫印迹反应， 反应步骤简述如下： 作液，置室温下反应1～1．5h，弃一抗工作液，O．OlMPBs清洗5min×3次； (2)加入1：200稀释的生物素化的二抗工作液，室温下反应l～1．5h，同上清洗； (3)加入l：200稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温下反应1．1．5h，同 上清洗； (4)显色：将DAB O．OlM船s中，再加入30％H20210山，将膜 6mg加入10ml H2s04终止反应，用 浸入显色液中，于室温轻轻摇动，蛋白带呈棕黄色后加入2m01／l O．0lM PBs漂洗； (5)以凝胶扫描成像系统进行分析，蛋白表达半定量以各组与I组光密度(oD) 比值表示。 1．6统计学处理统计数据均以；士s表示，样本的均数比较及相关分析分别采用SPsS 12．O方差分析与双变量相关分析，P0．05为显著性水平。 2结果