促肝细胞生长素和其类似物的生物活性研究.pdfVIP

论文汇编 秆病 OJ-1 促肝细胞生长素及其类似物的生物活性研究 高春芳徐玲玲周长林赵文静孔宪涛 第二军医大学附属长征医院全军医学免疫诊断中·心200(M33 肝细胞坏死的程度和再生能力是重症肝病预后的决定性因 8．细胞外间质成分透明质酸(HA)的检测取生长状态良好 素。因此，人们一直致力于在肝病患者体内寻找可调控肝细胞分 裂增殖的活性因子并相继发现一些对肝细胞增殖有促进作用的 小时后换含2％FSC的培养基过夜。次日吸弃培养液，换用培养基 活性因子，如胰岛素样生长因子(IGF)，转化生长因子d(TGFct) 等，但这些因子均缺乏肝特异性。上世纪80年代以来，又报道两 物的空白对照。每个药物浓度及对照孔设置4复孔，24小时后收 集细胞培养上清，采用上海海军医学研究所的放免试剂盒检测细 种主要的促肝细胞增殖的活性物质：肝细胞生长因子(Hepatocyte stimulatorsub． 胞培养上清的HA水平。 growthfactor，HGF)、肝细胞刺激因子(Hepatic 9．含l型胶原基因启动调控序列与报告基因的重组体构建 stance，HSS)[旧。虽然两种因子在生物学功能上有许多相近之处， 采用高春芳等重组 5，具体方法为采用 并且在近年的国内文献中，常见到有将二者混为一谈的，但两者 构建的pCOL25、pCOLl 并非同一物质。目前国内市场上常用的促肝细胞生长因子(pHGF) 或其类似物属HSS类，主要从乳猪等动物肝脏中提取。本研究在 比较研究市场上多种pHGF样物质的基础上，深人研究了pHGF 对肝细胞和肝星状细胞增殖活性、肝星状细胞的细胞外间质产生 插入片段的启动调控活性，详细构建过程见已发表文献日。 活性、肝星状细胞的胶原基因启动转录活性的影响，为pHGF的 进一步临床应用提供实验依据。 一、材料和方法 1．正常人肝细胞株．购自中科院细胞库。肝星状细胞株 COLI．5、phCOL2 RSC—T6引进自德国亚琛RWTH大学。 2．培养基：DMEM(Gibco)，补充10％胎牛血清。 3．MMT试剂：称取MTI(Amesco)粉末250rag，加50m[PBS 性。 溶解，终浓度为5mg／ml，室温搅拌30rain，0．221_Lm滤膜过滤除茁， 待用。 4 pHGF或其类似物：分别为威佳等12种pHGF或其类似 物．剂型包括液体型和粉剂两种。 5．SDS一聚丙烯酰胺凝腔电泳试剂，购自华舜生物科技公 司。 6增殖实验 取生长状态良好的人肝细胞株及肝星状细胞 CAT_A405值，采用t检验进行统计学分析。 株按lxlOS／ml、1001J．1／孔接种，37℃5％C02培养24小时后换含二、结果 2％FSc的培养基过夜。次13吸弃培养液，换用培养基稀释的含不 1对细胞增殖活性的影响 同稀释度的pHGF应用液100“l／子L，同时设置不含药物的空白对 照。每个药物浓度及对照孔设置4复孔，24小时后加10rd／孑=L的进增殖作用，在一定浓度范围内呈剂量依赖性。不同产品的作用 MTT溶液，继续培养4小时后，吸弃培养上清，加100仙l／孔的强弱及最佳作用浓度不同。图1为其中一种活性较强的pHGF DMSO，培养板振荡】5分钟后，550rim波长下测定各}L的OD，值。 上述实验重复3次。 7 SDS—PAGE按照常规方法制备15％SDS—PAGE胶， 促肝索为固体剂型者，采用lml注射用水溶解，取15ul直接加入作用，同样具有剂量依赖性。图2为具有较强抑制作用的另一种 等体积2×上样缓冲液中，液体剂型者直接取15ul加入等体积 2x上样缓冲液中，95℃加热处理5min后，上样。电泳电压为 10V／cm，电泳完成后采用常规考马氏亮蓝法或Gelcodeblue 制作用增强。 stain fPierce公司产品)进行染色，结果在Tannon凝胶成2对肝星状细胞系产生细胞外间质成分的影响