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第五章 固相析出分离法 * （三）薄层凝胶层析 用交联葡聚糖作为薄层层析的支撑载体，称“薄层凝胶层析”。 仅适用于分析 。 特点：? 生化分析； 设备简单，操作方便，分离迅速； 分辨率高； 同一薄板可同时分析数个样品； * 第四节 色谱峰变宽的问题 样品的洗脱曲线不是一个窄的矩形峰，而是一个较宽的高斯峰。 洗脱曲线： 样品的分子量分布， 仪器造成的峰加宽效应。 * 一、溶液通过色谱柱造成的峰加宽 Giddings提出的无规则行走模型。 溶质分子本身的运动是无规则的。 （一）分子扩散 （二）涡流扩散 （三）流动相中传质阻力 （三）固定相中传质阻力 * （一）分子扩散 浓度梯度 (HETP)d=2γDm/V （HETP）d—溶质分子纵向扩散对塔板高度的贡献 γ—扰动因子，表示柱内填料对于溶质分子扩散的扰动作用。 Dm—是溶质分子在流动相中的扩散系数；V—流速。 (1)小而均匀的填料 (2)适当的溶剂 (3) 提高流速 * （二）涡流扩散 与填料颗粒的形状，尤其是颗粒尺寸有关。 (HETP)e=2λdp dp—填料颗粒的直径； λ—是与填料及装填有关的常数。 (1)小而均匀的填料 (2)粒度一致且装得均匀 * （三）流动相中传质阻力 流动相在柱中的流速是不均匀的。 溶质分子有流速的梯度而导致溶质分子的浓度梯度，径向扩散。 （HETP）m=ωd2pV/Dm (1)填料装得规整、紧密。 (2) 采用粒度小的填料； (3)降低流速； (4) 选用合适的溶剂（溶质的扩散系数较大）。 * （四）固定相中传质阻力 在色谱柱中溶质分子的一部分F在流动相中，而另一部分（1—F）在固定相中。 分子从固定相中脱离出来到流动相中去，而另一些分子则从流动相进入固定相中。 结果： （1）溶质层变宽； （2）溶质层作为一个整体以FV的速度运动。 * 色谱柱内造成的峰加宽 填充介质粒度越小,峰加宽效应越小。 * 溶液在柱外产生的峰加宽 （一）连接管路 当液体流经细管时，径向速度梯度使矩形溶液脉冲变成抛物面形，并导致浓度的径向梯度。 减小管径 （二）检测池 * 二、峰宽的表示方法 W是峰宽，它是通过曲线的两个拐点的切线和基线交点之间的距离。 拐点之间的距离等于2δ，δ称为峰的标准偏差。 δ是衡量峰的宽度的量。 W=4δ * 分离效果—分离度 分离效果用两个峰的峰尖距离以及两个峰的峰宽来表示。 分离度Rs的定义为： 选择性决定分离能力，表现在两个峰之间的距离上； 柱效决定峰的扩张程度，表现在峰宽W和标准偏差σ上。 * 分离能力： 填料颗粒的孔径大小 孔径分布 溶质分子量分布. 柱效： 溶质分子的扩散 填料的粒度和分布 填料颗粒的几何形状 柱子的尺寸 流速 * 第五节 凝胶层析的应用 一、脱盐和浓缩 二、分子量测定 三、分离纯化 * 一、脱盐和浓缩 脱盐用的凝胶多为大粒度的，高交联度的凝胶。 交联度大，凝胶颗粒强度好；凝胶粒度大，流速高。 样品体积最好小于内水体积的三分之一。 * 浓缩 采用包埋法 直接投入法 * 二、分子量测定 在凝胶的分离范围内，不同分子量的物质其洗脱体积Ve及分配系数Kd值随分子量增加而下降。 对于一个特定凝胶柱，待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式 Ve=-KlogM+C * 分子量的测定 （1）求解法:（两个已知分子量的蛋白质过柱） Vel=C－KlogM1 Ve2=C－KlogM2 （2）标准曲线法:（先以3个以上已知分子量的标准蛋白过柱 ）: 标准曲线法准确性较高 * Ve与分子量的关系 图7.29 一些球蛋白分子量与Ve的关系 柱：40×2.4cm；洗脱液；0.05mol/L Tris-HCl缓冲液pH7.5（含0.1molKCl） 1．大豆胰蛋白酶抑剂；2．细胞色素C二聚体；3．胰凝乳蛋白酶原；4．卵清蛋白；5．血清白蛋白； 6．血清白蛋白二聚体；7．γ-球蛋白；8．甲状腺球蛋白；9．蔗糖；10．胰高血糖素；11．细胞色素C5611； 12．细胞色素C5611；13．核糖核酸酶；14．α-乳清蛋白；15．肌红蛋白 * 三、凝胶层析在生化制药中的