登革Ⅱ型病毒E蛋白基因原核及真核表达质粒的构建.pdfVIP

郑州大学2006届硕士研究生论文摘要 登革lI型病毒E蛋白基因原核及真核表达质粒的构建 ／ 登革II型病毒E蛋白基因原核及真核表达质粒构建 研究生 李东英 导师 曲传智 安静 郑州大学基础医学院病原生物学教研室(郑州450052) 第三军医大学基础部微生物教研室 (重庆400038) 中文摘要 研究的背景及目的： 登革病毒(DengIle 均可以引起登革热(Classical dcnglle shock h哪。玎hagicfe、，e佃IengIle 列为全球流行最严重的传染病。但DV的发病机理不明，临床治疗也主要是支持疗法和 对症疗法对症为主。近年来，在世界范围内和我国南方以及东南亚，DHF∞SS的发病 率有明显增加的趋势，可见登革病毒的感染已是严重的公共卫生问题。 的病理变化；②病毒因素致病理论：认为病毒毒力或复制能力等因素是导致严重疾病的 原因；③免疫病理反应理论：认为交叉反应性T细胞介导的细胞免疫损伤是DHF／Dss 的主要病理机制。尽管传统的减毒活疫苗已进行多年的临床试验，但是到目前为止，仍 没有安全有效的登革疫苗用于临床。因此，登革新型疫苗的研究极为迫切和重要。 码相应的蛋白。结构基因(占病基因组20％以上)影响着病毒的组装，进入宿主细胞和 免疫反应。E蛋白是Dv病毒体上包膜糖蛋白与最大的结构蛋白，由495个氨基酸组成， ’本课题为国家自然科学基金项助 塑型盔堂!!些堕堡土翌窒生堡苎塑鐾 塞芋II型病毒E蛋白基因原核及真核表达质粒的构建 ～ 分子量约为60kD。黄病毒属病毒的E蛋白既是病毒的吸附蛋白，介导病毒与细胞表面 受体的特异性结合，也是诱导机体产生保护性免疫反应的主要抗原。其高级结构的研究 显示E蛋白分3个功能区域：DomainI、Ⅱ、III，其中Domain I诱导产生特异性非中 和抗体，DomainII介导病毒的膜融合并诱导产生交叉反映性中和及非中和的抗体， DomainⅡI识别结合宿主细胞表面的受体，是病毒与宿主细胞吸附的关键区域。目前通过 对E蛋白的分析，寻找只产生保护抗体而不产生增强感染作用，又能激活抗病毒感染所必 需的特异性细胞免疫的决定簇研制，是DV新型疫苗研究的重要候选分子，也是探讨 DV致病机理、从中寻找治疗突破口的靶点。prM是膜蛋白M的前体，该蛋白除具有极 好的抗原功能区外，还有助于E蛋白的成熟和稳定，当prM和E基因共同表达时，E 蛋白具有与天然结构类似的三维构象。因此，prM和E基因是新型疫苗研究的重要靶标。 基于以上的认识，本实验以分子生物学的方法克隆出登革病毒2型(DengIlevinls DV的致病机理等积累实验材料。 材料与方法： 列，利用生物软件分析后各自设计一对特异性引物，通过ImPcR扩增出prM．E基因和 E蛋白的基因序列，分别将其插入克隆载体pMD．19simplevector中，各自命名为 接，构建出重组质粒pl砌强一hrGFP-laE，pMDl9-E与原核表达载体pGEx．6P．1连接， 构建出重组质粒pGEx．6P-1．E，。对重组质粒进行鉴定，结果正确后测序，并通过生物 软件对E蛋白基因进行序列分析和比较。 结 果： 建。测序的结果表明所克隆的E蛋白的核苷酸片段为1485bp，编码495个氨基酸，所 克隆的核苷酸片段与GellBank中报道序列相似性99．3％，氨基酸序列相似性为98．5％。 氨基酸，其测序结果显示为正确的序列。