重组白细胞抑制因子与水蛭肽嵌合蛋白质量标准研究.pdfVIP

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白质量标准研究 辛中帅，李克坚，杨化新，梁成罡 (中国药品生物制品检定所，北京i00050) 【摘要】目的建立重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TNHH)的质控方法和质量标准．方法采用 抗凝血酶活性试验和抗白细胞粘附试验测定活性；通过胰蛋白酶消化分析该蛋白还原型肽图：利用 版三部相关规定进行．结果用建立的方法分别对一批TNHH原液和成品进行了检定，各项指标均符合《人 用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和现版《中国药典》的要求．结论建立的质控方法和质量标 准可有效地控制TNHH产品质量，并可用于TNHH原液及成品的常规检定。 ’ 【关键词] 白细胞抑制因子；水蛭肽；质量标准 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TN删)是一种通过基因工程技术改造的新型嵌合蛋白，由 inhibitory Da， 而抑制白细胞的聚集及其对血管内皮细胞的粘附作用，其机制可能为NIF竞争性的与中性粒细胞表面的 粘附糖蛋白有高亲合力的结合，从而抑制其与内皮细胞的结合。Hirulog是一种凝血酶的特异性天然抑 制剂，具有强大的抗凝作用，体内外活性试验均表明可有效地抑制血栓的形成口1。该嵌合蛋白具有NIF 和Hirulog的双重活性，临床上可用于急性脑栓塞后的脑组织损伤修复，减少脑水肿，防止微小血栓形 成，改善微循环，是一种非常有前景的心脑血管疾病治疗药物。 由于本品属于我国自主开发的全新重组蛋白类生物制品，目前尚无法定质量标准可供参考，因此急 需建立相关质控方法和质量标准用于该产品的质量控制。本文对大肠杆菌表达纯化的重组产品原液及其 制剂进行研究，建立了相应的质量标准和检定方法。 1材料与仪器 岛津lOAD、20AT高效液相色谱仪，MettlerAE240分析天平，Thermo31ll二氧化碳培养箱，Amersham Biosciences EPS601电泳仪，PRECISDIG水浴锅，SPECTRAmaxl90酶标仪。 学细胞中心)；琥珀酯(PMA)、TPCK处理的胰蛋白酶、TFA(Sigma公司)；DIG DNA标记和检测试剂盒(Roche 公司)；E 成品(批号及理化对照品(批号由重庆富进生物工程有限公司提供。 2方法与结果 2．1生物活性测定 1．1．1抗凝血酶活性测定 mmol·L～Tris—HCI，1．0 参考凝血酶滴定法bJ，样品用稀释液(50 15腿·mL叫浓度，吸取i00儿加入0．5％纤维蛋白原溶液i00儿，混匀后加入100IU·mL-1凝血酶溶液 10儿，以上均在冰上操作。同时以样品稀释液作为空白对照。然后将样品和空白同时置于37℃水浴中， min 计时观察，每隔1 min内凝固，供试品在2 min取出倒置轻摇，观察是否有凝固出现。空白对照应在1 后凝固即判定为每mL终浓度样品不低于10个单位的抗凝血酶活性。试验测得原液每mg蛋白的活性不 低于800单位的抗凝血酶活性，表明该嵌合蛋白有较强的抗凝活性。 1．1．2抗白细胞粘附活性测定 取清洁级小鼠脾脏，按文献方法分离淋巴细胞…，并用1640培养液制成浓度为1．0×10。个·mL-1 457 的细胞悬液，备用。样品用稀释液(将PMA用DMSO配成l mmol·L叫的溶液，临用前用1640培养液稀释 100倍)配成200垤·mL_1浓度。取5mL灭菌玻璃试管，依次加入O．5mLl640培养液、0．5IllL供试品 溶液以及0．5 000