2010食品生物技术实验-基因工程.docVIP

实验一、实验二 动物组织DNA的提取及核酸浓度的测定 实验目的 掌握DNA的提取原理和方法； 学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。 实验原理 1. CTAB法提取动物组织DNA： CTAB法原理：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 2. 紫外吸收法测定核酸的含量和纯度： 组成核酸分子的碱基，均有一定的吸收紫外线特征，最大吸收值在波长为250-270nm之间。例如，腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶为267nm， 鸟嘌呤为276nm，胸腺嘧啶为264.5nm，尿嘧啶为259nm。这些碱基与戊糖，磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为确定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，1 OD的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单链DNA或RNA为40μg/mL，单链寡聚核苷酸为20μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。分光光波法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260／A280)估计核酸的纯度。 实验仪器与试剂 实验仪器 紫外/可见分光光度计、电子天平 、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、漩涡振荡混匀器 实验试剂 细胞裂解液（50mM Tris-HCl PH 7.5；1.5% CTAB；1M NaCl；15mM EDTA ）； 沉淀液（1% CTAB；50mM Tris－HCl PH 7.5；10mM EDTA）； 20mg/ml蛋白酶K；氯仿；1.2M NaCl；RNase；3M NaAc；冰乙醇；超纯水； 实验步骤 1．动物组织DNA的提取及质量鉴定 1.1 消化 称取100mg动物组织肌肉柱，冲洗干净，用无菌纸吸干，切碎；然后加入400ul裂解液（50mM Tris－HCl PH 7.5；1.5% CTAB；1M NaCl；15mM EDTA ）和12ul 20mg/ml蛋白酶K，置于55℃中过夜。 1.2 提取 ①将过夜的肌肉柱加入600ul氯仿，混合3min，静置2min，12000g离心2min。 ②取上清，加入500ul氯仿，颠倒混合1min， 12000g离心2min。(重复上述步骤直至上清无沉淀) ③取上清，加入500ul沉淀液（1% CTAB；50mM Tris－HCl PH 7.5；10mM EDTA；）混匀，静置2min，65℃水浴10min。 ④12000g 离心 10min，弃上清，留沉淀。 ⑤加入200ul 1.2M NaCl，轻轻混匀至DNA完全溶解，再加入6ul RNase ，置于37℃下15min。 ⑥加入1ml 冰乙醇和100ul 3M NaAc，-20℃下5min，中间混匀一次， 15000g离心10min，所得沉淀即为DNA。 ⑦弃除上清，再加入1ml 70％冰乙醇清洗， 12000g离心5min 。 ⑧将DNA沉淀于无菌空气中晾干，加入20ul无菌水溶解沉淀，置于4℃备用。 2．紫外吸收法测定核酸的纯度和得率 ①取6 μL待测DNA样品，用蒸馏水稀释至3ml (500倍) 。 ②用蒸馏水做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。 ③加入待测DNA样品在三个波长处读取OD值。 ④根据OD值计算DNA浓度或纯度。 [dSDNA]=50×（OD260-OD310）×稀释倍数 纯DNA样品的OD260/OD280 大约为1.8，若OD260/OD280介于 1.7-1.9之间，说明质量较好，1.8 为最佳；低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有 RNA 污染。 五．注意事项 1. 动物组织尽量剪碎，以提高DNA的抽提效率； 2． 氯仿除蛋白过程，重复几次，直到氯仿和水的界面没有蛋白质的沉淀； 3． 用70%乙醇清洗DNA沉淀后，尽量把酒精除干净，必要可以用滤纸条小心吸干； 实验思考与总结 1．提取DNA的过程原理、所添加试剂的作用 实验三、实验四 线粒体COI基因的PCR扩增及凝胶电泳 一．实验目的 了解 mtDNA的基本特性； 掌握PCR的原理与过程； 掌握DNA凝胶电泳的原理。 二．实验原理 动物细胞的mtDNA 是共价闭合的双链DNA ，基因组小，分子量范围在1512～1918kb 之间，基因组中不含间隔区与内含子、无重复序列，无不等交换，无基因重组、倒位、易位等畸变。与核基因组不同的是线粒体基因组严格遵守母系遗传方式，因而1