刚地弓形虫肌动蛋白解聚因子基因的生物信息学分析、克隆表达与免疫保护性研究.pdfVIP

刚地弓形虫肌动蛋白解聚因子基因的生物信息学分析、 克隆表达及免疫保护性研究 李雅清1，祝建疆1，王海龙1，殷丽天2，关丽1，张铁娥1，孟晓丽1，殷国荣卜 1山西医科大学医学寄生虫学研究所，太原03000l； 2山西医科大学生理学系，细胞生理学省部共建教育部重点实验室，太原030001 【摘要】目的对刚地弓形虫肌动蛋白解聚因子(殛ADF)基因进行生物信息学分析，并对该基 因进行克隆、表达，表达产物纯化后分析其抗原性；观察重组弓形虫肌动蛋白解聚因子(r殛ADF) 免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答和抗弓形虫感染的能力，探讨r强ADF作为弓形虫候选疫苗的 sOPMA、MotifScan、 DNAMAN生物信息学软件，分析、预测强～DF蛋白的理化性质、可溶性、表面可及性、跨膜区， 翻译后修饰位点、亲(疏)水性、二级结构、抗原表位、三维模型等。 第二部分：取ADF原核表达及免疫原性分析。收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取总RNA； 设计合成引物并引入B口Ⅲ日I和砑DI酶切位点，RT．PcR扩增编码强ADF的基因片段克隆到原核表 Ni—NTA层析法纯化蛋白，用His标签抗体及兔抗弓形虫血清做westem blo劬19分析。 第三部分：观察不同剂量r殛ADF滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答。BALB／c小鼠40 只随机分为5组，免疫组分别用10腭、20腭、30烬、40腭r殛ADF／只滴鼻免疫小鼠，免疫3次，分 PBs中，对照组用等量PBs滴鼻。末次免疫后第14d， 别于第0、14、2l天各一次，r及ADF溶于20“l 颈椎脱臼处死小鼠，ELIsA法检测肠液、鼻咽冲洗液及膀胱冲洗液的IgA和血清IgG。分离培养脾 含量。综合多项指标确定最佳免疫剂量。 第四部分：观察30烬r您ADF滴鼻免疫小鼠诱导的免疫保护性。BALB／c小鼠60只随机分为2 PBs中免疫小鼠，分别于第0、14、21天各一次，对照组用等量PBs 组，用30岖r取ADF溶于20“l 滴鼻。末次免疫后第14d，分别用l×104个速殖子(慢性感染，免疫组和对照组各8只)或4×104个 速殖子(急性感染，免疫组和对照组各22只)／只灌胃攻击小鼠。30d后颈椎脱臼处死慢性感染后小 鼠，计数肝、脑组织内弓形虫速殖子，并观察记录急性感染小鼠健康状况及其存活情况。 结果 通过生物信息学分析，刚地弓形虫ADF有4个表面可及性参数21．9的区域、、1个柔韧性参数 得分三2的区域、5个翻译后修饰位点、7个潜在抗原表位，可能具有免疫原性，成为弓形虫候选疫 苗。 基金项目：国家自然科学基金(No +通讯作者，E—mail：guorongyin@163．com 139 中高效表达，相对分子量(蚴·)约20kDa。wbstem 体及兔抗弓形虫免疫血清识别。 Po．05)，组间差别无统计学意义；IL．10含量，与对照组相比并未增高。综合以上指标，确定30烬 为较佳免疫剂量。 现竖毛、倦怠、活动及饮食减少等表现，30d后对照组小鼠无存活，免疫组小鼠存活4只。 结论 生物信息学分析可知，刚地弓形虫ADF存在7个潜在抗原表位，可能具有免疫原性。成功构建 重组质粒pET30a(+)一蜘F， 并在大肠杆菌中高效表达。30嵋组r啪F滴鼻免疫有效诱导了 黏膜和系统免疫应答，并有效降低弓形虫感染小鼠肝、脑组织内虫荷。本研究结果表明，刚地弓形 虫ADF具有免疫原性，诱导了较强的免疫应答并有效抵抗弓形虫感染，可能作为弓形虫疫苗的候选 抗原。 【关键词】刚地弓形虫；肌动蛋白解聚因子；生物信息学；原核表达；滴鼻免疫 作者简介：李雅清，女，山西医科大学在读硕士研究生，研究方向为基因与蛋白功能。