人2型糖尿病红细胞膜的蛋白质组学的研究.pdfVIP

摘要 糖尿病是对现代人健康威胁最大的疾病之一。对糖尿病多年的研究取得了一 些成果，但仍然有许多未解决的问题，糖尿病的发病机理、对患者机体的损伤机 制、高血糖对患者的病理影响、胰岛素抵抗的机制都没有完全明了，也没有找到 较好的根治方法。在糖尿病患者中，血液是病理作用的重要靶组织，患者血液长 期处于高血糖、胰岛素分泌紊乱等特征病理条件下，这很可能引起红细胞膜蛋白 的损伤或改变。随着蛋白质组学技术的发展，及其在疾病研究中的应用，越来越 多的研究者利用蛋白质组学的分析方法，来探索各种人类疾病的分子机制；寻找 引起疾病的关键蛋白质；筛选对疾病的诊断、治疗、预后和新药开发都有重要意 义的标记分子。为了探索2型糖尿病病变机制，结合本实验室在蛋白质组学方面 已经开展的工作和实验条件，本文从比较蛋白质组学的角度，比较正常人和糖尿 rafts蛋白的表达变化情况，以期找到在糖尿病患病 病人红细胞膜蛋白及膜Lipid 过程中起关键作用的蛋白质，为糖尿病临床诊断、治疗和预后检测提供可利用的 分子标记，并在此基础上进一步探讨糖尿病的病变机制。 用2DE／MS方法进行红细胞膜蛋白质组学分析，首要要解决的关键是高效和 高质量的膜蛋白的分离，我们在整个实验中，选择了多种去垢剂，尝试不同的配 方来提取完整的红细胞膜蛋白质，经过对比及抽提方法和上样、聚焦条件的优化， 选择0．5％ASBl4，5M尿素，2M硫脲，50raMDTT作为膜蛋白的溶解液；使用了 17era的非线性预制胶条，等电聚焦60，000vhr；得到重复性较好，分辨率较高 一分离得至lJ600个左右的蛋白质点的二维电泳图谱。利用PD．Quest软件分析比较 正常人和糖尿病人红细胞膜蛋白二维电泳图谱的差异，发现表达水平有显著性差 异(Po．05)的蛋白质42个，其中27个蛋白质点的表达在糖尿病人中升高，15 个则降低。对这些候选蛋白质进行选择，取3个蛋白质点进行基质辅助激光解析 电离一飞行时间质谱(MALDI．TOF)分析，得到蛋白质的肽指纹图谱，并在网 l C；Flotillin-I： 上数据库进行搜索，鉴定得到了这些蛋白质分别是：Syntaxin Arginasel。 l在细 对这些在糖尿病人红细胞膜上发生差异的蛋白质进行分析。Syntaxin 胞中与囊泡和质膜的融合有关，细胞中GLUT4转运到质膜上在肌肉和脂肪细胞 中主要是依靠囊泡的运输、搭靠和膜的融合，将葡萄糖转运蛋I；t4(GLUT4， Glucose transporter4)分子固定在细胞膜上，从而发挥转运葡萄糖及其它糖类的功 能；Flotillin-1存在与脂筏上，往往和信号转导分子关联，预示着它在信号转导中 起着一定作用，肌肉和脂肪组织中新的胰岛素依赖型的葡萄糖代谢信号转导通 路，该通路不依赖于PI(3)K(Phosphatidylinositol一3一OHldnase)，当胰岛素和其受 体结合后，通过级联反应，激活CAP(Cbl．associatedprotein)，但只有当CAP蛋白 和Flotillin-1结合并转移到细胞膜的特定区域时，才能与Cbl结合并激活下游反应， 最终GLUT4通过胞吐作用与质膜融合并参与葡萄糖运输； Arginasel可通过与 一氧化氮合成酶(N0s)竞争底物--L．精氨酸使后者生成尿素和L．鸟氨酸，调节 细胞内NO的生成，一氧化氮(NO)是种具有多种信号转导功能的独特分子， NO表达异常和多种疾病相关，如糖尿病、动脉硬化和高血压等。 1)片断，利用蛋白质一蛋白质相互作用的方法， 蛋白1(GLUTl，Glucosetransporter 研究它们之间的相互作用。使用Far-Western和Pull．downassay方法验证了 除了Cdb3Pb，红细胞膜上还存在另一条途径将膜和细质相互偶联，即膜上的 了研究它们在细胞内的功能，我们初步尝试在真核体系表达Flotillin蛋白，验证 方案的可行性，接着研究蛋白的共定位及性质和功能，对进一步