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乳鼠心肌细胞分离.doc
Neonatal Rat Cardiomyocyte Isolation Protocol
作成者:富海英 趙卉
日 期:2006/08/11
提前准备Autoclave法消毒器具:
镊子 大和小 各两把,用纸包好后放入一个玻璃杯中
放入搅拌棒的50cc的烧杯一个
第一天(次日开始培养的话,提前:17~21時)
Hanks medium 15ml加入P10培养皿,共三枚,置于37℃ incubate
(其中2枚在取心脏时备用)
Hanks medium是室温保存,没时间的话,不用incubate 37℃也可
从新生大鼠取心脏(以下以两窝计算)
铺上草纸、
准备酒精消毒液和尸体袋
取出心脏(从剑突左下用尖镊子刺入,分离, 心脏将突出体外)
用镊子把心脏夹出,放在P10培养皿中
将全部大鼠的心脏取出后,把心脏移到新的培养皿中
然后拿到无菌操作台(cleanbench)里面行进一步操作
将P10 dish中的心脏的血液挤出洗净后移到另一个干净的p10培养皿,枚目のdishに移将心脏撕裂2-3下,裂而不断的程度即可。
将Trypsin/EDTA 放入50cc三角烧杯中、两窝大鼠心脏约20个需要10ml。4℃ 过夜。
Trypsin不要加温、在取心脏之前从4℃保存的冰箱里取出,将需用部分取出注入带刻度试管中。
Trypsin不要加热,以免影响效果。4℃过夜,静置即可。
第二天(12-16h后:早上9点开始)
试剂:
D-MEM (cat No. D5796, containing 10%FCS and 1%PSG)
FCS (JRH Bioscience Cat No. 12303-500M)
PSG (GIBCO Cat No. 10378-016)
GIBCO Hank’s balanced salt solution(Cat. No. 14175-095)(不含Ca,Mg离子)
Collagenase Type II (Worthington Bio. Chem. Cat No. CLS2)
最终浓度0.5~1.0mg/ml
BSA (Sigma) 最终浓度5mg/ml
0.25%Trypsin-EDTA(GIBCO、cat No. 25200)(4℃直接使用,不加温)
配制胶原消化液:Collagenase type II(25~50mg)/BSA(250mg)/Hanks medium 50ml
在过夜的心脏/Tripsin瓶中加D-MEM(10%FCS)10ml, 37℃恒温槽5min
弃上清,加胶原消化液10ml(0.22um filter过滤)
(弃上清时注意勿把心脏组织吸走了。)
置于37℃恒温槽、1min用手轻摇 。
(这一步是为了将collagenase里的Trypsin/DMEM洗出,超过1分钟会分解过度,一定控制在1分钟以内。)
弃上清、将心肌组织移入有搅拌棒的50cc烧杯中。
(该时间点,如果有少量分解的心肌组织液进入上清液中的话,不咬在意,随上清一起弃之)
加12ml Collagenase/BSA(0.22um filter过滤)
置于震荡器上37℃ 15min(杯里的搅拌棒会被伴随震荡,从而达到搅拌的效果)
将上清移入新的50cc刻度试管中
重复10)-12)的步骤2次(总共3次)
(如果两次心肌组织就全部分解了的话,总共2次液可以)。
离心1000rpm 5min
弃上清,加D-MEM 30ml,轻轻拍打管壁使得心肌细胞悬浮其中,而后分种在3枚P10的培养皿中、
37℃、70min incubation(这一步是使纤维细胞贴壁)
使用Auto-pipet(自动移液器)、用上清液冲洗P10培养皿,而后将上清移到50cc烧杯中
(冲洗是为了把没贴壁的心肌细胞冲脱, 10~20次冲洗就足够)。
可进一步用5ml medium冲洗培养皿、将其移到50cc烧杯中(这样做,可增加细胞回收率)
离心1000rpm 5min
細胞数计数
根据不同的实验、种植适当的细胞浓度。
2窝一般能获得4.5~6.0×107个心肌细胞
总结来说:1.0.08%胶原II+0.125%胰2.消化前后一定要3.重100次)4.5.当然血清,板都要6.别忘了检查CO2温箱的情况
dfctb:1,第一次消化下来的上清要倒掉,你是2,你取心PBS里,再做下一个。3,你胰0.1%就可以了。消化4,5,用差速6,最好只取心室就行了。7,乳鼠在酒精里浸泡一会消毒后就可以做了,不要等乳鼠死了再做,。
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