乳鼠心肌细胞分离.doc

Neonatal Rat Cardiomyocyte Isolation Protocol 作成者：富海英　趙卉 日　期：2006/08/11　 提前准备Autoclave法消毒器具： 镊子　大和小　各两把，用纸包好后放入一个玻璃杯中 放入搅拌棒的50cc的烧杯一个 第一天（次日开始培养的话，提前：17～21時） Hanks medium 15ml加入P10培养皿，共三枚，置于37℃ incubate （其中2枚在取心脏时备用） Hanks medium是室温保存，没时间的话，不用incubate 37℃也可 从新生大鼠取心脏（以下以两窝计算） 铺上草纸、 准备酒精消毒液和尸体袋 取出心脏（从剑突左下用尖镊子刺入，分离， 心脏将突出体外） 用镊子把心脏夹出，放在P10培养皿中 将全部大鼠的心脏取出后，把心脏移到新的培养皿中 然后拿到无菌操作台（cleanbench）里面行进一步操作 将P10 dish中的心脏的血液挤出洗净后移到另一个干净的p10培养皿，枚目のdishに移将心脏撕裂2-3下，裂而不断的程度即可。 将Trypsin/EDTA 放入50cc三角烧杯中、两窝大鼠心脏约20个需要10ml。4℃ 过夜。 Trypsin不要加温、在取心脏之前从4℃保存的冰箱里取出，将需用部分取出注入带刻度试管中。 Trypsin不要加热，以免影响效果。4℃过夜，静置即可。 第二天（12-16h后：早上9点开始） 试剂： D-MEM (cat No. D5796, containing 10%FCS and 1%PSG) FCS (JRH Bioscience Cat No. 12303-500M) PSG (GIBCO Cat No. 10378-016) GIBCO Hank’s balanced salt solution（Cat. No. 14175-095）（不含Ca,Mg离子） Collagenase Type II （Worthington Bio. Chem. Cat No. CLS2） 　　　　　　　　　　　　最终浓度0.5~1.0mg/ml BSA (Sigma)　　　 最终浓度5mg/ml 0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO、cat No. 25200）（4℃直接使用，不加温） 　　配制胶原消化液：Collagenase type II(25~50mg)/BSA(250mg)/Hanks medium 50ml 　　在过夜的心脏/Tripsin瓶中加D-MEM（10%FCS）10ml， 37℃恒温槽5min 　　弃上清，加胶原消化液10ml（0.22um filter过滤） （弃上清时注意勿把心脏组织吸走了。） 　　置于37℃恒温槽、1min用手轻摇 。 （这一步是为了将collagenase里的Trypsin/DMEM洗出，超过1分钟会分解过度，一定控制在1分钟以内。） 　　弃上清、将心肌组织移入有搅拌棒的50cc烧杯中。 　　　　　（该时间点，如果有少量分解的心肌组织液进入上清液中的话，不咬在意，随上清一起弃之） 加12ml Collagenase/BSA（0.22um filter过滤） 置于震荡器上37℃ 15min（杯里的搅拌棒会被伴随震荡，从而达到搅拌的效果） 将上清移入新的50cc刻度试管中 重复１０）－１２）的步骤2次（总共3次） （如果两次心肌组织就全部分解了的话，总共2次液可以）。 离心1000rpm 5min 弃上清，加D-MEM 30ml，轻轻拍打管壁使得心肌细胞悬浮其中，而后分种在3枚P10的培养皿中、 37℃、70min incubation(这一步是使纤维细胞贴壁) 使用Auto-pipet（自动移液器）、用上清液冲洗P10培养皿，而后将上清移到50cc烧杯中 （冲洗是为了把没贴壁的心肌细胞冲脱， 10~20次冲洗就足够）。 可进一步用5ml medium冲洗培养皿、将其移到50cc烧杯中（这样做，可增加细胞回收率） 离心1000rpm 5min 細胞数计数 根据不同的实验、种植适当的细胞浓度。 2窝一般能获得4.5~6.0×107个心肌细胞 总结来说：1.0.08％胶原II＋0.125%胰2.消化前后一定要3.重100次）4.5.当然血清，板都要6.别忘了检查CO2温箱的情况 dfctb：1，第一次消化下来的上清要倒掉，你是2，你取心PBS里，再做下一个。3，你胰0.1%就可以了。消化4，5，用差速6，最好只取心室就行了。7，乳鼠在酒精里浸泡一会消毒后就可以做了，不要等乳鼠死了再做，。