乳鼠心肌细胞分离.doc

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Neonatal Rat Cardiomyocyte Isolation Protocol 作成者:富海英 趙卉 日 期:2006/08/11  提前准备Autoclave法消毒器具: 镊子 大和小 各两把,用纸包好后放入一个玻璃杯中 放入搅拌棒的50cc的烧杯一个 第一天(次日开始培养的话,提前:17~21時) Hanks medium 15ml加入P10培养皿,共三枚,置于37℃ incubate (其中2枚在取心脏时备用) Hanks medium是室温保存,没时间的话,不用incubate 37℃也可 从新生大鼠取心脏(以下以两窝计算) 铺上草纸、 准备酒精消毒液和尸体袋 取出心脏(从剑突左下用尖镊子刺入,分离, 心脏将突出体外) 用镊子把心脏夹出,放在P10培养皿中 将全部大鼠的心脏取出后,把心脏移到新的培养皿中 然后拿到无菌操作台(cleanbench)里面行进一步操作 将P10 dish中的心脏的血液挤出洗净后移到另一个干净的p10培养皿,枚目のdishに移将心脏撕裂2-3下,裂而不断的程度即可。 将Trypsin/EDTA 放入50cc三角烧杯中、两窝大鼠心脏约20个需要10ml。4℃ 过夜。 Trypsin不要加温、在取心脏之前从4℃保存的冰箱里取出,将需用部分取出注入带刻度试管中。 Trypsin不要加热,以免影响效果。4℃过夜,静置即可。 第二天(12-16h后:早上9点开始) 试剂: D-MEM (cat No. D5796, containing 10%FCS and 1%PSG) FCS (JRH Bioscience Cat No. 12303-500M) PSG (GIBCO Cat No. 10378-016) GIBCO Hank’s balanced salt solution(Cat. No. 14175-095)(不含Ca,Mg离子) Collagenase Type II (Worthington Bio. Chem. Cat No. CLS2)             最终浓度0.5~1.0mg/ml BSA (Sigma)    最终浓度5mg/ml 0.25%Trypsin-EDTA(GIBCO、cat No. 25200)(4℃直接使用,不加温)   配制胶原消化液:Collagenase type II(25~50mg)/BSA(250mg)/Hanks medium 50ml   在过夜的心脏/Tripsin瓶中加D-MEM(10%FCS)10ml, 37℃恒温槽5min   弃上清,加胶原消化液10ml(0.22um filter过滤) (弃上清时注意勿把心脏组织吸走了。)   置于37℃恒温槽、1min用手轻摇 。 (这一步是为了将collagenase里的Trypsin/DMEM洗出,超过1分钟会分解过度,一定控制在1分钟以内。)   弃上清、将心肌组织移入有搅拌棒的50cc烧杯中。      (该时间点,如果有少量分解的心肌组织液进入上清液中的话,不咬在意,随上清一起弃之) 加12ml Collagenase/BSA(0.22um filter过滤) 置于震荡器上37℃ 15min(杯里的搅拌棒会被伴随震荡,从而达到搅拌的效果) 将上清移入新的50cc刻度试管中 重复10)-12)的步骤2次(总共3次) (如果两次心肌组织就全部分解了的话,总共2次液可以)。 离心1000rpm 5min 弃上清,加D-MEM 30ml,轻轻拍打管壁使得心肌细胞悬浮其中,而后分种在3枚P10的培养皿中、 37℃、70min incubation(这一步是使纤维细胞贴壁) 使用Auto-pipet(自动移液器)、用上清液冲洗P10培养皿,而后将上清移到50cc烧杯中 (冲洗是为了把没贴壁的心肌细胞冲脱, 10~20次冲洗就足够)。 可进一步用5ml medium冲洗培养皿、将其移到50cc烧杯中(这样做,可增加细胞回收率) 离心1000rpm 5min 細胞数计数 根据不同的实验、种植适当的细胞浓度。 2窝一般能获得4.5~6.0×107个心肌细胞 总结来说: 1.0.08%胶原II+0.125%胰 2.消化前后一定要 3.重100次) 4. 5.当然血清,板都要 6.别忘了检查CO2温箱的情况 dfctb: 1,第一次消化下来的上清要倒掉,你是 2,你取心PBS里,再做下一个。 3,你胰0.1%就可以了。消化 4, 5,用差速 6,最好只取心室就行了。 7,乳鼠在酒精里浸泡一会消毒后就可以做了,不要等乳鼠死了再做,。

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