实验六-酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定.pptVIP

酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定 蔗糖酶活性及比活性测定原理 + 蔗糖酶 蔗糖酶的酶活单位：在40℃水浴反应10min，测定吸光值A540，增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（U）。 蔗糖酶比活力测定：每毫克蔗糖酶蛋白所具有的活力单位，对同一种酶来说，酶的比活力越高，酶的纯度越高。 试剂 （一） 蔗糖酶的粗提及活性测定 （1）冰冻无水乙醇：1瓶/班 （2）0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer，2000ml （全班共用） （3）0.01mol/L蔗糖, 用0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer配制，200ml （大组共用） （4）2 mol/L NaOH， 1000ml （全班共用） （5）3,5-二硝基水扬酸(DNS)试剂：可配300ml （全班共用） 19.2克酒石酸钾钠溶于50ml水中（电炉加热溶解，不用沸腾），把.0.63克3,5-二硝基水杨酸(DNS)和26.2ml2 mol/L NaOH 加到酒石酸钾钠的热溶液中，电炉加热溶解，冷却到50-60℃，再加0.5克苯酚和0.5克亚硫酸钠．搅拌使溶解．冷却后加水定容至100ml，过滤，贮于棕色瓶中。 实验方法 （一）粗提取酵母蔗糖酶 （1） 量取5g的面包酵母，分几次研磨（加入少量石英砂）至粉状，再加入10-12ml的0.01mol/LPBS（pH 6.0），搅拌混合。置于小烧杯中。 （2） 置于－20℃冰箱中，反复冻融1-2次。 （二）热提取酵母蔗糖酶 （3） 解冻，然后置于离心管中，离心，转速11000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方法分别测蔗糖酶A的活性及蛋白含量（蛋白含量略）。 （4） 将上述上清液置于45℃的恒温水浴锅中，用玻璃棒缓慢搅拌30min，然后置于冰浴中迅速冷却5min。然后装入离心管中，离心，转速11000r/min条件下离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方法分别测蔗糖酶B的活性及蛋白含量。 （三）乙醇提取酵母蔗糖酶 （1）取上述第4步中的上清液10ml，缓慢加入10ml的冰冻的无水乙醇（乙醇的终浓度为50％），并轻轻的搅拌5min，此过程在冰浴中进行。然后装入离心管中，转速3000r/min条件下离心5min，离心后弃上清液，离心管倒置于滤纸上，尽可能去除乙醇残液。留沉淀。 （2）将沉淀用15ml的0.01mol/L的PBS（pH6.0）搅拌溶解30min，溶液为浑浊液，再离心，转速10000r/min条件下离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方法分别测蔗糖酶C的活性及蛋白含量。 表1 酵母蔗糖酶酶活性及比活力测定 试剂 对照管 粗提A1 粗提A2 热提B1 热提B2 醇提C1 醇提C2 0.1mol/L蔗糖（ml） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 2 mol/L NaOH（ml） 0.1 0 0 0 0 0 0 40℃恒温水浴准确保温10min 各组酶液（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.01 mol/L pH6.0 PBS（ml） 0.1 40℃恒温水浴中准确反应10min 2 mol/L NaOH（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 DNS（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 100℃沸水浴准确加热5min，立即冷却 蒸馏水（ml） 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，以对照管作空白 A540 0 酶活（U） 0 酶比活力（U/mg ） 0 酶比活力平均值（U/mg ） 0 注意： 对照管的颜色不能太深，如果太深，需要重新配蔗糖溶液。 实验结果分析 思考题： （1）比较哪种蔗糖酶的粗提方法使酶的活性及纯度较高。 （2）本实验中有哪些影响蔗糖酶活性的因素。