水牛体细胞克隆影响因素地研究.pdfVIP

自然科学篇(下卷) 水牛体细胞克隆影响因素的研究 陆凤花 石德顺 韦英明 杨素芳 韦精卫 潘红平 引 言 哺乳动物核移植是一项将一个外源细胞核与一个去核的卵母细胞结合，以产生大量遗传基因型相同动 物的技术。该技术在理论和实践上都具有极其重要的价值，特别是体细胞核移植技术的成功，不但可以在 短时间内大量繁殖遗传上完全相同的优良个体，加速品种改良的步伐，而且为动物遗传改良或转基因动物 研制提供了更优异的研究方法。正因为该技术对农业和生物等发挥着极其重要的作用，引起了人们的广泛 关注，因此该技术在最近几年得到了迅速发展和广泛应用，已先后在绵羊…、牛【2】、小鼠【，】、山羊【4】、 猪‘5|、兔㈤、猫‘’1、大鼠[81、引引、骡…、狗[¨】、雪貂‘121和水牛‘131等十几种动物获得成功。 水牛是中国的主要牛种之一，因其耐粗饲、役力大、乳质好、易调教、利用年限长等优点而倍受人们 的重视，具有巨大的潜在经济价值。然而，由于我国目前水牛种群的生产性能低劣，繁殖率很低、产奶性 能低下，急需应用先进的繁殖技术对其进行改良。体细胞克隆技术是提高良种水牛繁殖率，加快水牛改良 步伐的一项有效技术措施。但是，目前关于水牛体细胞核移植技术的研究进展缓慢，很多因素影响水牛体 细胞克隆胚胎的发育。其中，受体卵母细胞的成熟培养、供体细胞的来源等都与克隆胚胎能否正常发育有 关。 本研究将以水牛成纤维细胞为供体细胞，从屠宰场收集的卵巢上获取的卵母细胞作为受体胞质，探讨 水牛卵母细胞成熟培养和供体的年龄以及性别对水牛核移植效果的影响；同时将克隆囊胚移植到同期发情 的受体水牛子宫角，观察其在体内的发育能力，从而进一步完善水牛体细胞克隆程序，以提高水牛核移植 的效率。 1材料与方法 1．1 卵母细胞的收集及体外成熟 从屠宰场收集的水牛卵巢上抽取2—6mm卵泡的卵母细胞，挑选出细胞质均匀、并带有完整卵丘细胞 在38．5℃、5％CO：和最大饱和湿度的培养箱中培养22—24h。 1．2供体细胞的制备 水牛耳皮的组织块经70％酒精消毒，洗净后去掉毛和软骨，将剩余的皮肤剪碎至2ram左右小块，用 0．25％胰蛋白酶消化30分钟，再用0．2％胶原酶消化45分钟分离细胞，细胞最终悬浮在含有10％胎牛血 供体细胞为培养2—5代的成纤维细胞。细胞生长形成单层并相互汇合后，用0．1彬IIllAPD培养处理 24h，再用0．5％FBS饥饿培养2天，即可用作核移植供体细胞。 1．3卵母细胞的去核、注核及融合 ·第一作者系广西大学副教授。 ·-——192．．．． 农业、林业及畜牧水产业 并沿去核时在透明带留下的孔进去，先回吸少量细胞质，再将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中，使 供体细胞与卵膜紧贴在一起，以便有利于融合。融合时，将注核卵母细胞移到电极间的融合滴中并将其摆 正，使待融合的两质膜平面与电场方向垂直，然后施加2．0V交流电波后，再用100v／mm直流电波、 15pa、脉冲3次，诱导体细胞与卵母细胞质融合。 1．4核移植重组胚的激活处理及体外培养 中培养7～9d。培养液每隔48h更换1次，重组胚培养48h后检查其分裂率，7天后记录发育的囊胚率。 1．5克隆胚胎的移植 将发育到囊胚期的新鲜或冷冻／解冻的克隆胚胎用非手术法移植到同期发情的受体水牛子宫角中。移 植后2—3个月进行直肠检查，以确定妊娠情况。 1．6实验设计 1．6．1 实验一本实验主要探讨受体卵母细胞在添加EGF的成熟液中培养的核移植效果。在添加或不添 加EGF的成熟液中培养的水牛卵母细胞去核后，移入水牛耳部成纤维细胞到卵周隙后经电融合构建核移 植重组胚，通过评定胚胎的早期发育能力，观察其核移植效果。 1．6．2实验二本实验主要是探讨供体年龄对水牛核移植效果的影响。将来自不同年龄个体(3月龄胎 儿、5～6岁、22岁)的水牛耳部成纤维细胞分别移入去核的水牛卵母细胞卵周隙中，通过电脉冲诱导细 胞融合，然后评定其核移植胚胎的体外发育能力。 1．6．3 实验三本实验主要是对来自不同性别的水牛成纤维细胞的核移植效果进行比较。分别将雌、雄 性水牛耳部成纤维细胞注入到去核卵母细胞卵周隙中，采用电融合法构建重组胚，通过评定胚胎的早期发 育能力，观察其核移植效果。 1．6．4实验四本实验主要是探讨水牛体细胞克隆胚胎在体内的发育能力。采用非手术法，将来源于水 牛胎儿成纤维细胞的克隆囊胚分别移植到受体水牛的子宫角，探讨其在体内的发育