外源雪花莲凝集素GNA基因原核表达产物对根结线虫室内毒力的研究.pdfVIP

658 植物保护与现代农业 外源雪花莲凝集素GNA基因原核表达 产物对根结线虫室内毒力研究+ 杨腊英麻琼丽黄俊生” (中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南省热带农业有害生物检测 监控重点实验室，儋州571737) 摘要：雪花莲外源凝集素(GNA)对刺吸式昆虫和某些咀嚼式昆虫以及多种线虫均有 毒性。本试验通过克隆GNA基因并进行原核表达，采用表达的蛋白作为线虫的培养液，测试 了含信号肽的GNA基因表达蛋白与成熟GAN基因表达蛋白在不同浓度下对南方根结线虫 (Meloidogyneincognita)的抗生效应，结果表明GNA基因表达蛋白对南方根结线虫具有明显 的致死性。 关键词：雪花莲外源凝集素；原核表达；根结线虫；抗生效应 nivalis 雪花莲凝集素(Galanthus 种，主要对刺吸式口器害虫如桃蚜Myzuspersicae、褐飞虱Nilaparvatalugens、二点黑尾叶 也有中等毒性，但对高等动物没有毒性，而其他所试的各种酶、酶抑制剂和非石蒜科外源 凝集素对上述害虫无效。目前国内外对GNA的研究很多，尤其是转GNA基因的转基因植 物如玉米、水稻、棉花、小麦等，这些转基因植株对所测试的害虫均具有一定的抗生 效应。 结合甘露糖的活性，重组蛋白对稻褐飞虱具有与天然GNA相似的毒性[1’21；罗素兰等也将 GNA的成熟蛋白基因在大肠杆菌中成功表达并研究发现GNA重组蛋白对蚜虫的存活发育 与繁殖等方面均有显著的影响旧o。其结果表明可用简单快速的原核表达系统合成GNA， 用于其他害虫的体外抗虫试验，或作为防治上述害虫的生物工程农药。为探讨GNA外源 表达产物对南方根结线虫有无抗生性，构建了GNA基因的表达载体并进行了原核表达， 开展表达产物对根结线虫的室内毒力研究。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1质粒与菌种 ·基金项目：国家科技基础条件平台建设资助项目(2005DKA21201—18)等 @sohu．uA)m ．．通讯作者：黄俊生，研究员，主要从事微生物农药领域研究，E．mail：H8881ll@126．corn 研究论文 送。 - 1．1．2试剂与引物合成及DNA测序 marker DL2000均购自宝 限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、x-gal、IPTG、dNTP、DNA 生物工程(大连)有限公司。低分子量蛋白质标准购自北京欣经科生物技术有限公司， 丙烯酰胺、N’，N’一亚甲双丙烯酰胺、N’，N’，N’，N’一四甲基乙二胺、十二烷基磺酸钠 酶、蛋白酶K、胰化蛋白胨、酵母膏、糖均购自昆明杰辉生物技术有限公司海南办事处。 其他化学试剂均为国产分析纯。 。 引物合成在北京塞百盛基因有限公司完成；DNA测序在大连宝生物公司完成。 1．2方法 1．2．1 引物设计 GGCAACTACAAG，rrACAAAATGG，下画线表示Nco GGACAATA邢GTACTCC，下画线表示BamH TACTITGCCGTCACAA，下画线表示Xho 序列。 1．2．2G^M基因的克隆 10pmoL／L、DNA模板10ng、Taq 4min；940C 1％琼脂糖凝胶电泳检测，按PCR产物回收试剂盒回收目的片段并将回收片段克隆到 Vector，转化E．coliXL．1感受态细胞，筛选阳性克隆，得到的重组质粒命名为 pMDl8．T pMD—GNA。 PCR产物酶切、电泳检测、连接、感受态制备、转化、小量质粒DNA提取等步骤均 见《分子克隆实验指南》HJ。 1．2．3表达载体的构建 用NcoI或BamHI和Xho