期末報告 - 生物資訊學系 - 中華大學.docVIP

中華大學生物資訊學系系統開發專題報告 專題組員:專題編號：PROJ2011-BIOINFO-9713 指導老師:老師 摘要 簡介絨柄金錢菇Flammulina velutipes﹞，屬小火焰菌屬(Flammulina)，它是極少數能耐霜的蘑菇之一，為常見的食用菇。人工種植的金針菇較白、較細，是因為使用冷氣房栽培未接受日照的結果。 [1] (2)抗菌胜肽： 在生物體中的一種先天免疫系統內的天然殺菌劑，稱為「抗菌胜肽」（antimicrobial peptide），大部分的抗菌胜肽帶正電，且具有疏水性和親水性。 而大部分的細菌都帶負電，細菌的細胞膜主要是由磷脂質分子排列成雙層結構，表面是親水性，帶負電，當有細菌入侵到生物體內時，抗菌胜肽會因正負相吸原理靠近細菌，抗菌胜肽的疏水端會將細菌脂質分子的親水端推開，與細胞膜上疏水的碳氫鏈相接，因此會平貼在細胞膜上，進一步地把膜上的脂質推開，使兩旁的疏水端接在一起。被推開的脂質分子，會因疏水端的碳氫鏈彎曲，為了填補多餘的空間，而使得整個膜變薄，當吸附過多的抗菌胜肽，就會使細胞膜的延展到達極限而破洞。當破洞產生後，附著在細菌上的抗菌胜肽會全部聚集到洞口，並垂直的進入，把洞口固定並不讓細胞膜有機會縮回，而細胞內的物質就可以自由進出，最後細胞會因為滲透壓失衡而導致細菌死亡。[2] 專題進行方式antimicrobial peptide ,AMPs)，目前金針菇尚未有人尋找出抗菌胜肽，因此選擇金針菇為我們的物種。 金針菇從量販店所購買，載體(Vector) 從LB培養基中，挑取一顆單一菌落培養於3c.c含有100μg/ml Ampicilln LB培養液抽取plasmid DNA。 (二)Primer (三)萃取金針菇的Total RNA 根據植物病理學會期刊的方法，來萃取金針菇的Total RNA。[5] 首先取些許的金針菇放置研缽中，並迅速加入液態氮並磨碎後，取0.1g的金針菇組織裝入離心管，加入500ul已加熱過(80℃)的RNA buffer(0.1M Licl,10mM EDTA,1% SDS,100mM Tris-HCL,PH 8.0)，混合均勻，再加入1ml的酚氯仿(pheno chloroform)，上下搖晃均勻，接著離心12,000rpm，5分鐘(分3層，底層透明液體，中層組織，上層上清液)，取上清液，並加入等量體積的4M LiCl，放入-80℃，冰域20分鐘後，離心12,000rpm，10分鐘，倒掉上清液，並加入400ul DEPC H2O、40ul 3M醋酸鈉及800ul異丙醇，放入-80℃，沉澱1.5小時，離心13,000rpm，15分鐘，倒掉上清液，放置烘箱風乾後，加入200ul DEPC H2O回溶後再並加入等量體積的phenol chlorform，離心11,000rpm，3分鐘，取上清液，並加入40ul 3M醋酸鈉和1ml異丙醇，並上下搖晃，使他混合均勻，放入-80℃，沉澱1小時後，離心10,000rpm，10分鐘，倒掉上清液，風乾，加入20ul DEPC H2O回溶，保存於-80℃待用。 圖(二)、RNA電泳圖 (四)反轉錄反應(RT) 用引子(cDNA library Forward和cDNA library Reverse)以及反轉錄酶，去做反轉錄反應(Reverse Transcriptase，RT) 。 萃取RNA濃度約1μg及加入primer，放於65℃加熱2分鐘，冰上1分鐘，接著加入200U/ul的反轉錄酶(MMLV Reverse Transcriptase)，合成cDNA。再以25℃加熱10分鐘，37℃加熱60分鐘，85℃加熱5分鐘去放大cDNA片段，冰上放置1分鐘，-20℃保存待用。 (五)PCR 取cDNA濃度約1μg，加入5U Taq聚合酶(Taq polymerase)、引子(cDNA library Forward、cDNA library Reverse)及10Mm dNTP，接著設定PCR溫度(如圖三)。 PCR產物加入1/10倍體積的3M醋酸鈉和2倍體積酒精，進行沉澱1小時，用UVddH2O回溶，取1ul跑膠(如圖四)，剩餘的PCR產物保存於-20℃待用。 圖(三)、PCR反應循環過程圖 圖(四)、PCR沉澱後電泳 (六)PCR產物和Vector(pET23a)加限制酶(EcoRI、NotI) A.PCR產物 PCR產物加入1/10體積的3M醋酸鈉和2倍體積的酒精，冰於-20℃，沉澱1小時，UVddH2O回溶，再加入限制酶EcoRI、NotI，放入水浴槽37℃加熱2小時，放置水域槽65℃加熱20分鐘，使限制酶失去活性後，再使用Clean and Extractio