毕业论文：米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质研究.docVIP

毕业论文：米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质研究 毕业论文：米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质研究 毕业论文：米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质研究:2013-5-11 20:21:44题目：米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质研究院 （系） 化工学院 专 业 生物工程 届 别 2012届 米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质研究摘 要戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway, PPP）是生物体糖代谢的重要途径之一，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH, EC 1.1.1.49）是PPP途径最关键的氧化还原酶之一，它催化的反应伴随着还原力NADPH和6-磷酸葡萄糖酸-δ-内脂的生成，参与氨基酸、脂类及核苷酸等细胞组成物质的合成代谢，对细胞正常生长和代谢有重要影响。同时，G6PDH表达水平调控着葡萄糖糖酵解途径转向PPP途径的代谢流进而影响胞内NADPH的浓度。本论文成功表达了来源于米曲霉的G6PDH基因（gsd），并对经表达、纯化后的酶进行了酶学性质研究，为今后米曲霉PPP途径代谢调控研究奠定基础。主要研究结果如下：以米曲霉CICC2012为实验菌株，提取米曲霉总RNA，反转录PCR（RT-PCR）得到菌株的全长cDNA。以cDNA为模板，根据NCBI上报道的gsd的mRNA序列，设计引物，采用融合PCR技术，扩增出gsd的cDNA片段，构建重组表达载体pET-32a-cDNA-gsd，并转化到大肠杆菌E. coli BL21(DE3)，成功诱导大肠杆菌过量表达gsd。序列测定和结果分析表明，gsd基因序列大小为1888 bp，含有355 bp内含子，开放阅读框长度为1533bp，编码510个氨基酸，蛋白亚基分子量约为59 kDa。大肠杆菌表达的G6PDH，经Ni2+柱纯化得到电泳级纯化蛋白，G6PDH酶活性与大肠杆菌粗酶液相比，由12.94 U/mg提高到73.6 U/mg，G6PDH纯化倍数为5.69，纯化的回收率为56.3%。工程菌表达纯化后G6PDH的最适反应pH为7.5，最适反应温度分别为40℃，Mg2+、Ca2+和Mn2+对G6PDH酶活力具有促进作用，Co2+、Cd2+、Hg2+ 和Zn2+对其酶活力具有强烈的抑制作用。关键词：米曲霉；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；表达与纯化Gene expression in Escherichia coli and enzymatic properties of G6PDH from Aspergillus oryzaeAbstractGlucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH, EC 1.1.1.49) is one of the key enzymes of pentose phosphate pathway, which generates reducing power NADPH and 6-phosphate gluconic acid-δ-fat, involved in the anabolic of amino acids, lips and nucleotides, plays an important role in normal cell growth and metabolism. The expression level of G6PDH regulates the metabolic flux of glucose glycolytic pathway turn to the PPP pathway, thereby affecting the concenctration of intracellular NADPH. In this paper, G6PDH gene (ecoded by gsd) were expressed and purifiedfrom Aspergillus oryzae. The purified enzymes were also characteriazed. The research will lay the basis for the metabolic regulation of PPP from Aspergillus oryzae. The main findings were as follows:The totoal RNA of Aspergillus oryzae was extracted and the fu