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Western Blotting 常见问题及解决方法 1.比较均一的高背景 原因： 解决办法 抗体浓度太高 优化/降低一抗和二抗浓度 封闭液不适合 比较尝试不同的封闭液 封闭不完全 封闭液的选择与优化 增加封闭液中蛋白质浓度 优化封闭时间和温度（RT至少1小时；4°过夜） 封闭液中加入Tween-20；浓度0.05％ 抗体稀释液中加入Tween-20；浓度0.05％ 抗体与其它蛋白质交叉反应 更换不同的封闭液；勿在Biotin/avidin体系中使用脱脂奶粉封闭 降低二抗浓度 检测二抗与膜的交叉反应性 原因： 解决办法 漂洗不完全 增加漂洗时间和缓冲液体积 漂洗液中加入Tween-20；浓度0.05％ 曝光时间太长 缩短曝光时间 膜的问题 使用干净镊子；戴手套操作 换一张新膜 用足够的液体，膜始终保持湿润 孵育时使用脱色摇床 避免膜重叠，互相覆盖 小心操作，勿毁损膜 缓冲液污染 使用新缓冲液 过滤缓冲液 2. 斑点、发泡式或闪烁式的高背景 原因： 解决办法 抗体浓度太高 优化/降低一抗和二抗浓度 二抗聚集 0.2um过滤或更换新二抗 封闭液不适合 比较尝试不同的封闭液 封闭不完全 封闭液的选择与优化 增加封闭液中蛋白质浓度 优化封闭时间和温度（RT至少1小时；4°过夜） 封闭液中加入Tween-20；浓度0.05％ 抗体稀释液中加入Tween-20；浓度0.05％ 抗体与其它蛋白质的交叉反应 更换不同的封闭液；勿在Biotin/avidin体系中使用脱脂奶粉封闭 减少二抗浓度 检测二抗与膜的交叉反应性 原因： 解决办法 膜没有正确湿润 使用干净镊子；戴手套操作 换一张新膜 用足够的液体，膜始终保持湿润 孵育时使用脱色摇床 避免膜重叠，互相覆盖 小心操作，勿毁损膜 缓冲液污染 使用新缓冲液 过滤缓冲液 仪器污染 保证所有仪器，用具干净 确保膜上无残留胶 3. 信号弱或者无信号 原因： 解决办法 转膜不完全 1.转膜后，染胶以决定转膜效率 2.使用Memcode染膜以决定转膜效率 3.保证转膜时胶与膜充分结合 4.滤纸－膜－胶，电极方向正确装配 5.根据说明书，对膜进行处理如湿润 6.电转时防止过热 7.使用阳性对照或预染Marker 8.优化转移时间和电流 9.使用Pierce转膜缓冲液 10.保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇） 蛋白质与膜结合不充分 加20％甲醇于转膜缓冲液； 低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜 抗体 增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性 抗原不足 增加上样量 抗原被封闭液遮蔽 试用不同的封闭液 优化封闭液中蛋白质浓度 缩短封闭时间 缓冲液里有叠氮钠 去掉叠氮钠 曝光时间太短 延长曝光时间 底物孵育时间太短 5分钟 膜的选择错误 Pico底物首先推荐使用NC，PVDF膜需要条件优化 Duro/Femto底物，推荐使用NC； PVDF；尼龙或电荷修饰的尼龙膜 底物丧失活性 Pico/ Duro底物室温稳定12个月 Femto底物室温稳定至少6个月 底物与二抗孵育发光检测 保证两种底物成分没有交叉污染 膜被剥离过 剥离会导致抗原丢失或变性 避免重复检测 膜上蛋白质被消化（gelatin) 封闭物质可能有蛋白质降解活性 蛋白质在储存过程中降解 重新制备样品 4. 非特异性条带 原因： 解决办法： 底物太灵敏 ? 交叉反应 ? 抗原浓度太高 ? 抗体浓度太高 降低抗体浓度 SDS非特异性结合到胶上的蛋白质 1.转膜后充分清洗 2.不用SDS 5. 弥散型条带 原因： 解决办法： 抗体浓度太高 降低抗体浓度 蛋白质上样量太多 降低蛋白质上样量 6. 白色条带/黑点/信号下降太快 原因： 解决办法： 抗体浓度太高 1.降低抗体浓度，特别是二抗浓度 7. 部分区域发黑或有信号 原因： 解决办法： 不完全转膜 1.确保胶与膜之间无气泡 2.湿润膜 3.用干净的镊子或手套以避免污染 4.换新的膜 5.保证膜孵育时，膜没有互相覆盖