重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达优化和佐剂活性研究.pdfVIP

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB) 的表达优化及佐剂活性研究 雷清黄思扬应莲芳梁凌宇 蒋琳 长春生物制品研究所，长春，130062 【摘要】为了提高重组LTB的蛋白表达量，该实验将表达宿主B121(DE3)更换为BL21Star(DE3)、向培 养基中补加终浓度o．5％的葡萄糖、低温培养诱导等方法，使LTB获得较高水平表达，且目的蛋白为可溶性。 在提高表达量的基础上，又用CM．FF纯化方法对其进行了纯化，并与铝佐剂对比做了小鼠免疫试验，为确立 LTB的黏膜佐剂活性奠定了基础。 【关键词】不耐热肠毒素B亚单位(m)；蛋白纯化；粘膜佐剂； 大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是肠产毒性大肠 1．2化学试剂 ．WrG、卡那霉素、DNA 杆菌(ErIEc)分泌的一种热不稳定(65℃，30min即失 活)肠毒素，是由A、B两种亚单位组成的AB；型杂 司；蛋白质Marker购自Sigma公司；胰蛋白胨，酵母 六聚体蛋白，能引起人和猪等家畜的严重腹泻¨J。 cima公司；Tris等其它生化试剂均为国产分析纯。 LT与霍乱毒素(CT)的初级结构具有80％的同源 性[2】，也具有相似的三级结构bJ。LT不仅是一种有 1．3仪器 VDSPharmbta 效的黏膜免疫原，而且也是一种良好的黏膜免疫佐 凝胶扫描影像系统为Imagemaster 剂。外源蛋白经黏膜途径免疫效果往往不理想，常 需要应用佐剂来增强免疫效果；研究发现LT可被用 作黏膜佐剂，通常认为B亚单位五聚体与GMl神经品；550型酶标仪为日本Bio—RAD公司产品。 节苷脂结合是LT分子免疫原性所必须的b]，其本身 2．方法 也具有较高的佐剂活性。 2．1重组体pET21b．LTB的表达优化 目前LT作为一种强有力的黏膜免疫佐剂，已应 用重组体pET21b．LTB提取质粒，然后将此质粒 转人B1221 用于多种病原的免疫研究【2J。但是LT的毒性限制 Star(DE3)宿主菌，所得新重组菌记作 b—LTB／S。 了LT作为免疫佐剂在人体上的应用，进一步研究表 pET21 明其毒性仅限于A亚单位，故研究者只采用其具有 佐剂活性而不具有毒性的B亚单位作为黏膜佐剂的 (‰+)的液体LB培养基中，37％培养过夜；次日以 研究对象。本研究通过改变重组LTB的培养条件， 使其表达量有了明显提高；同时又对目的蛋白LTB中，37％培养至OD600为0．4时，补加终浓度为0．5％ 进行了纯化，并用其与铝佐剂对照免疫小鼠，分析了 的葡萄糖，并加入终浓度为0．1mM的IPTG诱导剂， 将培养温度降至30℃，继续培养诱导4小时。 重组LTB免疫佐剂的生物学活性，为LTB作为黏膜 免疫佐剂的生物学研究提供了参考数据。 表达产物经离心收集菌体，加入0．02M的Tris— 材料与方法 别取破碎上清和沉淀制样，作SDS．PAGE凝胶电泳。 1．材料 分离胶浓度为13％，浓缩胶浓度为4．5％，用考马斯 1．1菌种 亮蓝染色。 2．2重组蛋白LTB的纯化 重组体pET21b．LTB由兰州生物制品研究所第 四研究室构建；宿主菌BL21