血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后缝隙连接蛋白Cx43表达的变化_医学论文.docVIP

血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后缝隙连接蛋白Cx43表达的变化_医学论文 血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后缝隙连接蛋白Cx43表达的变化_医学论文 作者：杨军, 伍卫 梁蔚文, 王景峰, 潘秋辉, 方昶 黄至斌 【摘要】 【目的】 研究血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后连接蛋白43 (Cx43) 表达的变化及与细胞周期分布的关系。【方法】 分离培养大鼠心肌细胞,用血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大,72h后用RT-PCR和免疫荧光方法观察心肌细胞Cx43基因和蛋白表达, 用流式细胞仪测定法观察心肌细胞周期分布变化以及Cx43 表达量的关系。【结果】 血管紧张素Ⅱ处理后的心肌细胞表现细胞肥大且细胞活力增强，S 期、G2-M 期细胞百分比增加, 细胞内G2-M（二倍体）DNA含量降低，Cx43 蛋白表达低于对照组，Cx43 mRNA 表达水平也较对照组明显下调，Cx43 蛋白表达下调与细胞周期分布的改变相关。【结论】 血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因表达明显下调，导致Cx43蛋白表达亦出现下调，这一改变可能与心肌肥大过程中的细胞周期变化有关, 提示血管紧张素Ⅱ可能通过调控Cx43基因的表达而参与缝隙连接重构过程，而Cx43表达的变化可能与心肌肥大的机制有关。 【关键词】 血管紧张素Ⅱ； 心肌细胞肥大； 连接蛋白43； 缝隙连接； 细胞周期 [J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):292-296]　　 心肌肥大是多种心血管疾病过程中的一个共同的病理过程，尽管心肌肥大曾被认为是心脏的一种适应性代偿反应， 但目前已认识到心肌肥大(myocardial hypertrophy) 是心血管疾病中的一种独立危险因素，心肌肥大本身即明显增加心血管病死亡率，而其内在机制认为与心肌肥大所致的电生理重构有关。目前发现细胞间缝隙连接的改变在心肌电生理重构起着重要作用。缝隙连接蛋白43 (connexin 43, Cx43) 是心肌细胞间隙连接的主要蛋白成分,该连接构成相邻细胞间亲水管道，对于细胞间信息传导,细胞的生长、分化及维持心肌节律性同步收缩有重要意义[1] 。有学者发现心肌肥大后的心肌Cx43 表达下降[2-4] ,但也有学者报道实验性高血压引起心肌肥大时其心肌Cx43表达无改变[5]或Cx43 表达增加[8]；而对于心肌肥大过程中Cx43改变的机制以及血管紧张素Ⅱ对缝隙连接蛋白重构的影响至今还鲜见报道，我们通过本实验观察了血管紧张素Ⅱ对心肌Cx43基因和蛋白表达及细胞周期影响,探讨心肌肥大过程中Cx43的变化及血管紧张素Ⅱ对缝隙连接蛋白重构的可能作用和机制。 1 　 材料与方法 1. 1 主要试剂和仪器 DMEM-F12培养基(Gibco) ；胎牛血清(BCS, 四季青公司)；血管紧张素Ⅱ (Sigma) ；5-溴脱氧嘧啶核苷(Sigma)；胰蛋白酶(Difco)；兔抗大鼠Cx43多抗(博士德公司)； FITC－羊抗兔IgG(博士德公司) 缬沙坦原药(北京诺华制药有限公司)；RNA逆转录试剂盒 (TOYOBO公司)；Trizol RNA提取液( MRC公司)；PCR 引物(北京赛百特公司合成)；PCR 主要试剂购自TAKARA公司；其它常用生化试剂均为国产分析纯。流式细胞检测仪(Epics Altra型,美国Beckman Counter公司)。 1.2 心肌细胞培养及分组 每次取1～3 d龄的Wistar大鼠20只，按改良的simpson法进行心肌细胞培养。主要过程为：将大鼠心室肌用0.25% 胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心弃上清后，加入含20% 胎牛血清的DMEM-F12培养液重新悬浮细胞。将细胞悬液转移至75 cm2 培养瓶中,置于5% CO2 培养箱内37 ℃差速贴壁90 min，再取未贴壁细胞均匀地接种96孔及6孔培养板上继续培养。仅在培养第一天中加0.1 mmol/L的5-溴脱氧嘧啶核苷抑制非心肌细胞生长，24 h后换无5-溴脱氧嘧啶核苷的培养基[8]。约3 d后, 心肌细胞成簇生长并出现搏动。1周左右, 细胞密集紧密接触，达到同步收缩，此时培养心肌细胞可用于实验。实验分为两组：血管紧张素Ⅱ组：每天所换培养液中加血管紧张素Ⅱ（以无血清培养液溶解）使终浓度为1.0×10-6 mol/L，正常对照组(control)：培养液中加等量无血清培养液。处理72 h后在显微镜下观察细胞形态，细胞计数，同时分别取两组细胞作MTT、细胞周期检测、免疫荧光和RT-PCR检测。 1.3 四氮甲唑蓝(MTT) 法测定对心肌细胞增殖的影响 　 采用MTT法检测细胞的增殖活性。取原代培养心肌细胞接种于96 孔平底细胞培养板上，每组10个孔，培养24 h，然后换含10 mL/L血清的培养液，24 h后,实验