四季金果 微生物试验操作技术与方法汇总.docVIP

微生物试验操作技术与方法汇总 1微生物基础实验 活菌计数方法 样品为液体，直接进行梯度稀释，即吸取1mL样品加入装有9mL无菌水或无菌生理盐水的试管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，即成10－1稀释液，从10-1稀释液中吸取1mL加入另一只无菌水或无菌生理盐水试管中，同样吹打均匀即成10－2稀释液，依次类推，连续稀释，制成10－3、10－4、10－5、10－6、10－7等一系列稀释菌液。无菌生理盐水：0.85%的NaCl溶液。 若样品为固体，准确称取样品25g，加入装有无菌水225mL并放有小玻璃珠的500mL三角瓶中，置摇床上震荡20min，使微生物细胞分散，静置20~30s后即为10-1稀释液，同样进行梯度稀释制成不同稀释度的菌液。 选择2~3个适宜的稀释液，吸取0.2mL菌液加入平板，用玻璃涂布棒将平板上的菌液涂布均匀，平放于试验台20~30min，使菌液渗入培养基，然后倒置于恒温培养箱培养24~48h，温度依不同类菌而定。每个稀释度做三个平行。菌落长出后即可计数。选取菌落数在30~300之间的平板进行计数，计算平均值。 菌种的分离纯化（涂布平板法） 先制备固体培养基。取0.1mL或0.2mL菌液加至相应编号的无菌培养皿中，涂布均匀，然后将其倒置于恒温箱中培养，制成可能含菌的琼脂平板。待菌落长出后，从平板表面挑取外观形态不一样的菌落，在新制备的平板上划线培养，挑单菌落进行镜检，看各个细菌形态、大小及颜色是否一致，如不一致，再重复以上操作数次，便可得到纯培养。将纯化后的菌株做甘油管进行保存。 形态观察 将菌株于固体平板上划线或稀释涂布，培养24h~48h，形成单菌落后观察菌落特征菌落形态：菌落形状和大小、边缘、质地、隆起形状及高度、透明度、菌落和培养基的颜色等。 细胞形态观察：细菌进行简单染色和革兰氏染色，酵母菌直接制作水浸片，于显微镜下观察。观察细胞形状及大小，革兰氏染色后的颜色等。 生理生化试验及鉴定 细菌 生长曲线的测定（以乳酸杆菌为试验菌） 取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。分别用5mL无菌吸管吸取2.5mL待试菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有50mLmRS的三角瓶内，混合均匀后分别取5mL混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存。用未接种的MRS液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用MRS液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。以OD值为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线。 乳酸菌产酸速率的测定 将所分离的菌种在培养基中30℃培养16~18h，以4％接种量接种至盛有50mL发酵培养液的三角瓶中，于30℃静置培养48h，每隔12h测定其pH值和总酸，筛选出产酸速度较快、产酸力较强的菌株并予以保存。总酸的测定采用NaOH滴定法，以乳酸含量计。pH值直接用pH计进行测定。 NaOH滴定法： 0.1mol/LnaOH标准溶液：称取120gNaOH于250mL烧杯，加入水100mL，置于聚乙烯塑料瓶，密封，放置数日澄清后，取上清5.6mL，加新煮沸过的并冷却的蒸馏水1000mL，摇匀。 NaOH的标定：精密称取0.6g（准确至0.0001g）105~115℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，加50mL新煮沸的冷蒸馏水溶解，加酚酞两滴，用NaOH滴定。 样品处理：取发酵液1mL，经加蒸馏水99mL稀释后加入酚酞指示剂两滴以滴定法直接测定。结果判断，三角瓶内液体由无色变为浅粉色，30s不退色，记录NaOH标准溶液的使用量。 乳酸（g/L）=N(V1－V2)KF/V0×1000 N:NaOH标准溶液的当量浓度；K：转化为乳酸的系数，即0.09；V1：滴定试液时消耗NaOH标准滴定溶液的体积，mL；V2：空白试验时消耗NaOH标准滴定溶液的体积，mL；F：试液的稀释倍数；V0：试样的取样量，mL。 接触酶试验 试剂 3%过氧化氢：30%过氧化氢原液100mL、水900mL，密闭、避光、低温保存。 方法 挑取固体培养基上培养24h的菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL（涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上），观察结果。于半分钟内产生气泡者为阳性，无气泡为阴性。 精氨酸产氨试验 试剂 蛋白胨氨化培养基：蛋白胨 5g，K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4 0.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0~7.2。 钠氏试