多能诱导干细胞（ips细胞）实验操作指南第四版-(汉恒生物技术文档).pdfVIP

IPS 操作指南第四版 IPS 操作指南第四版 IPS 简介： iPS 细胞是通过基因转染技术（gene transfection ）将某些转录因子导入动物或 入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC ）细胞样的 多潜能细胞。现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干 细胞。2006 年日本京都大学Shinya Yamanaka 在世界著名学术杂志《细胞》上率先报 道了诱导多能干细胞的研究。他们把 Oct3/4,Sox2、c-Myc 和 Klf4 这四种转录因子基因 克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS 细胞 在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能 力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。 现分别介绍一下小鼠的和人的iPS 的诱导步骤。 一、实验材料 慢病毒包装体系（来自汉恒生物，HanbioTM ）： 慢病毒表达质粒plvx-OCT4、plvx -SOX2、plvx -KLF4 和plvx-c-MYC （来自 汉恒生物，HanbioTM ）； 辅助质粒PSPAX2 和PMD2 （来自汉恒生物，HanbioTM ）； 病毒包装细胞：293T 细胞（来自汉恒生物，HanbioTM ）； ES Feeder 细胞：MEF （C57 ）（来自汉恒生物，HanbioTM ） 。 二、实验仪器和耗材 （一）实验仪器 二级安全柜、37 度培养箱、4 度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。 （二）实验耗材 PBS、无菌水、明胶粉、DMEM 培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、 血清替代物（SR ）、mTESR1、T75 培养瓶、无菌水、15ml 离心管、50ml 离心管，巴 1 上海市徐汇区斜土路1175 号 E-mail:service@ Tel：021 实验室地址：上海市浦东新区张江高科技园区 蔡伦路720 弄药谷孵化器1 号楼314 IPS 操作指南第四版 氏管等。 三、ips 诱导方法 （一）Feeder 细胞 1、Feeder 细胞的分离（MEF） 取妊娠 13.5-14.5d 的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏， 然后用PBS 进行冲洗。 2 将胎体剪碎成小于1mm 的组织块，1000rpm，3min，去掉上层PBS，加入0.25% 胰酶-0.04%EDTA 2~3ml 浸泡组织块，常温消化2~3min 。 轻微吹打，待较多细胞溢出后，加入等量的 10%FBS DMEM 终止消化，通过 100 目滤网过滤后，将获得的液体离心，1000rpm，5min 。 弃上清，加入培养基重悬细胞，调整细胞密度约2x105 个/ml ，用10%FBS 的DMEM 进行培养。 2、MEF 细胞的传代培养 在倒置显微镜下观察，当成纤维细胞汇合度达到80%~90%时，去掉培养基，用PBS 清洗两遍，加入2ml 0.25%胰酶-0.04%EDTA 消化液进行消化。 镜下观察，当细胞间出现裂隙，细胞变圆时，加入等量的MEF 培养液终止消化，并 用滴管反复轻轻吹打成单细胞悬液。 将单细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm 离心5min，弃上清，加入MEF 培养液 将细胞重悬，按1:2~3 传代。置于37 度、5%CO2 培养箱中培养。 3、Feeder 制备 选择对数生长期的MEF，在培养基中加入丝裂霉素C 在37 度，5%CO2 条件下处理 2~3h，加入的丝裂霉素C 浓度为0.4mg/ml, 使得终浓度为12ug/ml. 处理结束后，吸