高产克拉维酸的耐甘油突变株选育及生理特性研究_药学论文.docVIP

高产克拉维酸的耐甘油突变株选育及生理特性研究_药学论文 高产克拉维酸的耐甘油突变株选育及生理特性研究_药学论文 作者：陈锡永 史毓芳 王普 杨美芬 郭子芬 【摘要】 以带小棒链霉菌XC-1-35为出发菌株，经紫外线照射60s，并结合甘油耐受性菌株的理性筛选，选育得到较佳诱变株XC-5-48，效价达1970μg/ml。该菌株经斜面连续传代4次，效价稳定在1800μg/ml以上。对该菌株的生理特性研究表明，其具有活力较强的甘油特异诱导的甘油转运系统(GTS)。以XC-5-48菌株为试验菌株，当培养基中甘油初始浓度为1.5%，并且在发酵60h时补加1.0%的甘油，摇瓶发酵的效价可达2668μg/ml，较出发菌株(318μg/ml)提高了7.4倍。该工艺应用于15L发酵罐共十个批次的发酵试验，96h时克拉维酸的平均效价达2103μg/ml。 【关键词】 克拉维酸； 生物合成； 甘油； 菌种选育； 菌种特性 ABSTRACT The clavulanic acid-producing strain Streptomyces clavuligerus XC-1-35 with the yield of 318 μg/ml was irradiated by UV for 60 s, and a glycerol-tolerant mutant XC-5-48 with a high productivity of 1,970 μg/ml was screened out. Physiological characteristics for strain XC-5-48 showed that this mutant not only had a stable productivity of clavulanic acid after subculturing for fourth generations, but also had active glycerol transport system (GTS) which was specifically induced by glycerol. Under the optimum concentration of 1.5% glycerol in fermentation medium and feeding of 1% glycerol as precursor after 60 h of incubation, the titer of 2,668 μg/ml was obtained in shake flask culture, an increase of 7.4 times compared with the original strain. Fermentation for 96 h in 15 L fermentor, the average yield reached to 2,103 μg/ml. KEY WORDS Clavulanic acid; Biosynthesis; Glycerol; Breeding; Physiological characteristics 克拉维酸(clavulanic acid，CA)是由带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种β-内酰胺酶抑制剂［1］，虽然其自身的抗菌活性很低，但它可协同增强青霉素和头孢菌素对产生β-内酰胺酶的耐药菌的抗菌活性［2］，其与阿莫西林、替卡西林制成的合剂已在临床上广泛使用。近年来人们一直在致力于提高CA产量的研究［3，4］。 克拉维酸的β-内酰胺环上的碳骨架来自甘油的三个碳原子， 并且未经任何中间重新排列。 Minambres等［5］研究发现，生长在以甘油为唯一碳源的限定培养基中的带小棒链霉菌存在两种不同的转运甘油分子系统：其一是组成型的甘油转运系统；其二是由甘油特异性诱导的甘油转运系统(GTS)，透过细胞90%以上的甘油是由诱导的GTS转运的，其转运能力受到L-丝氨酸等物质的抑制。甘油缺乏时只能合成少量克拉维酸，却大量产生带小棒链霉菌的另一种代谢物头霉素［6］。甘油是生物合成克拉维酸所必需的物质，但当培养基中甘油含量超过110mmol/L时，克拉维酸的生物合成即受到抑制。李丹丹等［7］研究了带小棒链霉菌甘油耐受量与克拉维酸合成的关系，认为耐高甘油浓度的筛选方法可用于克拉维酸菌种的选育。孟勇等［8］以带小棒链霉菌CCRC11518(ATCC27064)为出发菌，采用物理和化学诱变剂处理，通过筛选抗终产物结构类似物舒巴坦钠突变株、底物甘油耐受性突变株、营养缺陷型突变株，获得一株克拉维酸高产突变株III50，摇瓶效价为834.8μg/ml。本文以带小棒链霉菌X