Taqman锁核酸探针实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA.pdfVIP

Taqman锁核酸探针实时荧光定量PCR 检测乙型肝炎病毒DNA 宋广辉王清伦立民王丽华 乙型肝炎病毒(HBV)是病毒肝炎的重要病原 体，发病范围扩展到全世界，特别是在亚洲，非洲、南 低温离心机等。 欧和拉丁美洲。估计有二十亿人感染HBV，并且超 4．血浆HBV核酸提取：采用PEG沉淀提取法，方 过4亿的慢性HBV携带者。检测乙型肝炎在血清法为100一血清标本与100斗l提取液I充分混合， 13000r／min×10 或血浆中的HBVDNA已成为诊断HBV感染和评价 min离心，弃上清，沉淀物中加入 000r／min× rain，经13 乙肝患者治疗疗效的一种标准实验室方法。另外， 25叫提取液Ⅱ打匀，煮沸10 由于HBV基因变异，血清学检测并非是决定性的10 min离心后，取2山上清液作为PCR扩增模板液。 HBV传染的诊断方法，HBVDNA的检测在诊断那 5．制备标准品：DNA用高保真PCR扩增系统扩 些不好确证的病例上特别有用。与其他商品化HBV增PCR产物，经质粒DNA纯化试剂盒纯化后，与 PUCm—T载体经T4DNA连接酶连接，转化大肠埃希 DNA的测量方法比较，实时PcR是一种更高敏感 性、更宽线性范围、测量更准确的方法。实时PCR 技术最近被认为检测和定量的核酸分子有效方法而 素的LB平板上筛选白色转化子菌落，增菌后用质粒 广泛应用。近年来，由于实时PCR快速、敏感、重复 提取试剂盒提取质粒DNA，测吸光度(A)值比值 性好和污染少，已作为病毒核酸的定量的金标准。 A瑚朋瑚，比值在1．6～1．8之间的质粒可用。测定 重组质粒PUCm．T—HBV提取物260nm吸光度，换算 材料与方法 成质粒的拷贝浓度并一20℃保存备用。使用时用 1．标本：巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、甲型肝炎 病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒l型病毒阳 范围浓度的标准品。 0．3 性标本和人类基因组DNA作为阴性特异性对照标 6．荧光实时定量PCR检测：引物Pl、P2 0．2 本由山东省分子病毒重点实验室提供。临床血浆标 mmoL／L，探针：P3 mmol／L， mmoL／L，Mg“3．5 200 本来自青岛大学医学院附属医院患者。EDTA抗dATP、dCTP、dGTP、dUlP 凝，分离血浆，置一20℃保存或立即检测。 酶5U／100一，UNG酶5 U／100山。置扩增仪中进行 2．引物与探针：PCR引物(Pl、P2)为l对HBV min，95℃3 扩增。扩增条件为：37℃5 min；95℃5s， 60℃30 X区基因特异引物，扩增该区片段长144bp，以上探 s，20个循环，荧光信号收集设在60℃。反 针和引物由爱