重组羧肽酶原B的体外复性与羧肽酶B的纯化研究.pdfVIP

重组羧肽酶原B的体外复性及羧肽酶B的纯化研究 张晓彦袁勤生 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237) 摘要：本课题组所构建的羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中获得高表达。但目的蛋白 是以包涵体的形式存在。为了获得活性羧肽酶B，必须对其包涵体进行变复性。利用稀释 复性和凝胶层析复性两种方法对羧肽酶原B的包涵体进行了复性研究。发现在最终蛋白 浓度相同的情况下，凝胶柱复性要优于稀释复性。复性后的蛋白质经过胰蛋白酶酶解后， arg为底物测活，得到的活性酶的比活为150u／mg。 关键词：羧肽酶B包涵体凝胶复性稀释复性 天然存在的羧肽酶B(水解酶EC3．4．17．2)是一种含锌原子的外肽酶，它可以特异 性地从肽链中去除C端的碱性氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。羧肽酶B在商业 和科研上有着很广泛的用途，它可用于蛋白质和多肽的序列分析|lI；在胰岛素的生产过 程中，羧肽酶B用于切割胰岛素原，使之变成为胰岛素；在医学上用于诊断胰腺炎12,3]。 目前商业上使用的羧肽酶B是从猪的胰腺纯化得到的，不仅价格昂贵，而且并不完全排 除其他酶。我们采用基因工程技术克隆了羧肽酶原B，并使其在重组的工程菌中得到了 高效表达。本文在此基础上对其表达所形成的包涵体进行了复性研究。为活性羧肽酶B 的生产提供了依据。 凝胶层析法复性是1994年由美国科学家WernerMH发展起来的一种固相复性的 新方法【4l。其原理是利用凝胶层析的过滤作用，降低蛋白之间的相互作用产生的聚集，从而 使复性液中蛋白浓度和复性率都得到很大的提高。同时，蛋白经过凝胶过滤层析本身也可 得到一定的纯化。凝胶层析法复性对蛋白质本身的性质没有什么特殊的要求，只要选择合 white 适分离范围的凝胶介质即可。因此该方法从发展以来，在很多蛋白，包括Henegg carbonic inteHukin一6‘4】 lysozyme(HEWL)、Bovine 等得到了很好的应用。谷振宇等人在此方法的基础上又发展了梯度脱除尿素的凝胶层析 法复性％使变性蛋白沿着预先形成的尿素梯度从高浓度的变性剂向复性缓冲液移动，从 而实现变性剂的梯度脱除，应用在溶菌酶的复性上，使复性效率比传统方法提高40％。 本文的工作首先用稀释复性法确定了基本缓冲液条件，然后采用尿素浓度梯度凝胶过滤 的方法，对羧肽酶原B进行了成功复性，在复性液中蛋白终浓度相同的情况下，比活比 稀释复性法提高了50％，显示了良好的应用前景。 1 材料与方法 1．1 菌种与质粒 124 质粒：pT7—473一pCPB，表达载体pT7-473，克隆菌株DH5 c【，表达菌株BL2I(DE3)， 本实验室保存。 1．2试剂 口分装)，胰蛋白酶(Sigma)Carboxypeptidase Sigma}SephacrylS一200，Pharmacia；DEAEFast Sepharose 余均为国产分析纯试剂。 1．3仪器和设备 分光光度计(UNICO，UV一2100)AKTAExNore纯化工作站。 1．4羧肽酶原B的表达和包涵体的收取与洗涤 挑取LB(氨苄青霉素100“g／n-d)平板上的单菌落接种于25mlLB液体培养基中，于 IPTG进行诱导，继续生长5小 于37。C生长至菌密度OD。约0．5～0．8时，加入0．5mM lmM 时后，离心收集菌体。将菌体悬浮在TE(20mMTris-HCl，pH8．0EDTA)中， Tris—HCl，1％ 加入100“g／ml溶菌酶，进行超声破碎。离心收集包涵体。用20mM Triton