油菜转基因育种的探究.pdfVIP

油菜转基因育种研究 官春云 李 构 陈社员 刘忠松 王国槐 熊兴华 林良斌 何业华 (湖南农业大学油料作物研究所 长沙 410128) 摘 要 本文介绍了Bt毒蛋白基因转化甘蓝型油菜育成抗虫新品系、墓因工程雄性不育系、恢复系选育 和杂种优势利用以及反义FAD,基因转化甘蓝型油莱双低品种提高油酸含量的研究结果。 关扭词抽莱，转基吟育oy 自1986年MathewVH等首先将NPI，一B基因利用农杆菌介导法转人芥菜型油菜以来，转 基因油莱研究有了长足的发展。据E.D.Earle和V.C.Knauf报道(1999)，从1988年到1997年 七年间，有45篇文章报道了34个不同的基因对甘蓝型油莱进行了遗传转化，并育成一些转基 因油菜品种在生产上应用。 据C.Jamm(2000)报道，1998年全球转基因油菜种植面积为240x100hmZ，占全球油菜种植 面积的9%.1999年全球转基因油菜面积为280xI(PhW，占全球油菜总面积(2500xh)002.1 的11%，年年有增加。另据C.James报道，2000年全球作物总面积为27100x1了hm2，转基因作 物面积为4420x1了h甘，转基因作物占全球作物种植面积的16%o 为了育成适于我国种植的转基因油菜品种，我们于1995年开始进行Bt毒蛋白基因、TA29 核酸酶基因、反义FADZ基因转化甘蓝型油菜的研究。现将主要研究结果报道如下: 1Bt毒蛋白基因转化甘蓝型油菜育成抗虫新品系的研究 1.1 宜义 莱青虫(Artogeia)是危害油菜的重要害虫，属鳞翅目，在我国长江流域地区一年可发生8- 9代，且世代重叠危害，严重影响油菜产里和品质形成，同时还可传播软腐病，在秋雨多的年份 常导致成灾。过去用化学农药防治效果不佳，且污染环境，又增加成本。而来自苏云金杆菌的 CryI类Bt毒蛋白基因所编码的蛋白质特异地对鳞翅目昆虫有杀虫活性，使油菜获得抗虫性， 并能在油莱中稳定遗传和表达。为此进行本研究。 1.2材料和方法 受体品种为湘油13号(B.napus)。农杆菌(Agrobacteriumtunufaciens)菌株为LBA4404。表 达载体为中国农业科学院生物技术中心范云六教授提供的pEWZ10质粒，含有经过人工构建 的Bt杀虫蛋白基因和筛选标记基因NP171I。农杆菌介导转化方法是:挑取含有pEWZl。质粒 的农杆菌单菌落接种于含四环素3mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过滤，至OD600达 0.5，然后离心收集菌体，用MS液体培养基洗两次，再用MS液体培养基稀释10倍。切取4- 5d无菌苗的子叶柄约2rma，在ms培养基(附加6一BA4.5mg/L)上预培养10h，放人稀释菌液中 浸染4一5min，用灭菌纸吸干菌液，插人共培养基(MS十6一BA4.5/Kenmycinl5mg/L)黑暗培养 印一72h。转移到筛选诱导培养基(MS+6一BA4.5mg/L十kan15mg/L+Cmheniclin500mg/L+ 人;NO}5mg/L)上培养(25C9，光照16h/d),3一4周后切取再生的绿芽于生长培养基(MS+ 官春云等:油菜转羞因育种研究 Kan15mg/L十Carb250mg/L十Kanl5mg/L)中，2一3周即可生根，待根系发达后移至盆钵。子 房注射的方法是:对即将开放的花蕾进行人工去雄，并套袋挂牌，在第2d.或第3d上午9:00- 10:00授粉，重新套袋。在授粉后一定时间内用微玻针(针口直径10一100P.tn之间)，从子房不 同部位注射 卜3匹质粒DNA，然后再套袋隔离2周，成熟后收获种子。转化成功后，对转基因 植株进行农艺性状和品质性状的选择。 1.3研究结果 1.3.1转化结果 以子叶柄作转化受体进行农杆菌转化，最佳侵染时间为3一5min，最佳共培养时间为60- 72h，在最佳转化条件下，35。个外植体共培养获得小植株14株，卡那霉素抗性植株频率为 8.3%。经Dotblotting和Southernblotting检测，转化频率为1.18%。采取子房注射法转化，在 授粉后20一30h从子房中部注射。.5一1.51+g外源DNA，在实验的25个子房中获种子674粒， 其中卡那霉素植株率为12.8%. 1.3.2 表达检测 对转基因植株进行GUS基因表达检测，结果呈阳性，表明Bt毒