多重PCR检测猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的研究.pdfVIP

猪传染病 多重PCR检测猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的研究 李小康1．2，崔保安1．2·，赵丽1．2，陈红英1．2，魏战勇1 (1．河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002； 2．河南省动物性食品安全重点实验室，河南郑州450002) 列，设计合成了两对特异引物，分别建立了PPV和PRV的单项PCR诊断方法，通过对扩增条件的筛选， 最终成功地建立了PPV和PRV的复合PCR诊断方法，即利用一次PCR反应，可同时扩增PPV的751bp 和PRV355 bp的特异性片段，而扩增猪圆环病毒II型(Pcv_2)及相应的培养细胞(PK．15)核酸结果均为阴性， 诊断。 关键词：复合PCR；检测；PPV；PRV 猪细小病毒(PPV)矛II猪伪狂犬病毒(PRV)均是引起猪的繁殖障碍的主要病原，二者在临床 上常呈混合感染。这两种病毒引起的疾病均以繁殖障碍为特征【l叫l，仅根据临床症状较难进 行鉴别诊断。传统的鉴别诊断方法是病原分离鉴定和血清学诊断方法，不仅费时费力，而且 敏感性和特异性都较差。PCR技术具有快速、特异、敏感和易于操作的特点，在畜禽传染 病的检测、鉴别诊断方面已得到了广泛应用。复合PCR技术是在PCR基础上发展起来的一 种检测技术。具有单PCR技术同样的优点，义能一次PCR反应就能同时检测多种病原，具有 简便、快捷、灵敏等优点，能满足生产上同时对多种疾病进行快速诊断的要求15咱】。为此， 我们进行了PPV和PRV的复合PCR诊断方法的研究。 1材料与方法 1。1病毒株和细胞株 猪细小病毒(PPV)7909标准毒株购自中国兽药监察所；猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环 病毒II型(PCV．2)由河南农业大学兽医微生物室保存；PK-15细胞株购自中国兽药监察所。 1．2主要试剂 marker TaqⅢ酶、DNA K购自华美生物工程公司。 1．3病毒增殖 1．3．1猪细小病毒的增殖 长成单层的PK一15细胞经胰酶消化吹散后按1：2传代，取培养液量的1／10的病毒液同 步接种细小病毒种毒，待细胞完全病变后终止培养，反复冻融2．3次，收集病毒液，．20℃ 贮存备用。 1．3．2猪伪狂犬病毒的增殖 将猪伪狂犬病毒接种于37。C培养长满单层的PK．15细胞，接毒量为生长液的1／10，37℃ 吸附1h，加入适量的生长维持液，当细胞病变(CPE)达80％以上时，终止培养，反复冻融 2—3次，收集病毒液，．20℃贮存备用。 】．4引物设计 猪细小病毒诊断_}{=l引物是根据Ranz报道的猪细小病毒VP2基因序列I『71，按照引物设计 原jjl0，借助计算机筛选设计的，扩增的片段为751bP，其序列为： P1 5’一p—’ACTTGGGGGAGGGCrr_3’ P25’．TGTTCCTGGGTG丁TGGTC．3’ 猪伪狂犬病毒诊断用引物是根据Klupp报道的猪伪狂犬病毒gH基因序列【8j，按照引物 设计原则，借助计算机筛选设计的1对引物，扩增的片段为355 bp，该对引物的序列为： P35。一GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT一3’ P45’一CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA．3’ 上述引物均由上海生：r生物工程有限公司合成。 第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会2006年会议论文集 1．5模板的制备 1．5．1猪细小病毒液模板DNA的制备 取增殖的病毒液300微升，加入等体积样品裂解缓冲液，混匀，再加人蛋白酶K(终浓 min， 度为200 r／min离心5 gg／m1)，5612水浴30min，然后加入等体积的平衡酚，混匀。10000 取上清，经酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)再次抽提后用2倍体积的异丙醇沉淀，．20℃放置30 min，12000咖1in离心10min，70％乙醇洗涤2次，干燥，加人20